雪糕中16 种反式脂肪酸的测定

宫慧丽，刘丽君，段国霞，刘春霞，李翠枝，吕志勇

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010110）

反式脂肪酸指含有1 个或多个反式构型双键的不饱和脂肪酸，其分子结构中2 个氢原子位于双键上碳链的两侧，其空间构象呈“一”字型[1-3]。反式脂肪酸有天然存在和人工制造2 种情况，牛、羊等反刍动物的脂肪和乳制品中天然存在反式脂肪酸；油脂在脱色、脱臭等精炼和煎炸过程中可产生反式脂肪酸[4-5]。反式脂肪酸不是人体必需的脂肪酸，对健康存在潜在危害，若食品中反式脂肪酸含量过多，人在摄入食物过程中摄入大量反式脂肪酸容易诱发老年痴呆[6-7]、心血管和肥胖等疾病[8-10]。为了避免反式脂肪酸可能对人体健康造成的威胁，需要注意控制食品中反式脂肪酸的含量，准确测定食品中的反式脂肪酸对于保证人体健康至关重要。目前，有气相色谱检测食用油[11-14]、奶茶[15]、沙拉酱[16]、巧克力[17]等中反式脂肪酸和气相色谱-质谱联用检测炸薯条和食用油[18]、母乳脂肪[19]及乳粉[20]中反式脂肪酸的相关报道，但气相色谱检测雪糕中反式脂肪酸的研究鲜见报道。

目前，GB 5009.257—2016《食品安全国家标准 食品中反式脂肪酸的测定》[21]方法的样品处理步骤较为复杂，在实际检测过程中，方法操作繁琐。本研究以GB 5009.257—2016和GB 5413.36—2010《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中反式脂肪酸的测定》[22]为基础，将复杂的实验过程简单化，并对前处理和色谱条件进行优化，利用气相色谱氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）对雪糕样品进行检测，峰面积归一化法进行定量分析，为雪糕中反式脂肪酸含量的测定提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

雪糕：市场随机抽取共10 种样品，雪糕类型包括巧克力类、含乳类和不含乳类，每种样品抽取1 支，其中涉及到的主要配料有：白砂糖、可可脂、可可粉、乳清粉、食用葡萄糖、葡萄糖浆、食用盐、全脂乳粉、无水奶油、食用植物油、麦芽糊精、乳清蛋白粉、全蛋粉、食用大豆分离蛋白、大米粉、小麦粉、红枣酱、山楂酱、蓝莓酱、浓缩菠萝汁等；能力验证样品为2020年Fapas样品。

标准物质：37 种脂肪酸甲酯混标（37 种脂肪酸甲酯中每种组分占2.63%）、异油酸甲酯对照品（纯度＞99%）、反亚油酸甲酯对照品（纯度＞99%）、亚麻酸甲酯8 种顺反异构体混标（反-9,12,15-十八碳三烯酸甲酯（C18:3n-9t,12t,15t）、反-9,12-顺-15-十八碳三烯酸甲酯（C18:3n-9t,12t,15c）、反-9-顺-12-反-15-十八碳三烯酸甲酯（C18:3n-9t,12c,15t）、顺-9-反-12-反-15-十八碳三烯酸甲酯（C18:3n-9c,12t,15t）、反-9-顺-12-反-15十八碳三烯酸甲酯（C18:3n-9t,12c,15t）、顺-9-反-12-顺-15-十八碳三烯酸甲酯（C18:3n-9c,12t,15c）、反-9-顺-12,15-十八碳三烯酸甲酯（C18:3n-9t,12c,15c）、α-亚麻酸甲酯（C18:3n-3））（纯度＞99%）北京盛科博源生物科技有限公司；岩芹酸甲酯对照品（纯度＞99%）、反-9-十六碳烯酸甲酯对照品（纯度＞99%）、反-6-十八碳烯酸甲酯对照品（纯度＞99%）、反-9-十八碳烯酸甲酯对照品（纯度＞99%）、反-11-十八碳烯酸甲酯对照品（纯度＞99%）、反-11-二十碳烯酸甲酯对照品（纯度＞99%）、反-9-顺-12十八碳二烯酸甲酯对照品（纯度99%）、反-13-二十二碳烯酸甲酯对照品（纯度＞99%）、顺-9-反-12-十八碳二烯酸甲酯对照品（纯度99%） 上海安谱实验科技股份有限公司；石油醚、乙醚、无水乙醇（均为分析纯） 天津富宇精细化工有限公司；异辛烷（色谱纯） 天津福晨化学试剂有限公司；盐酸（优级纯）、甲醇（色谱纯）成都科隆化学品有限公司；氢氧化钾（分析纯） 天津盛奥化学试剂有限公司；正庚烷（色谱纯） 天津光复精细化工有限公司。

1.2 仪器与设备

GC-2010 Plus气相色谱仪（配备FID） 日本岛津公司；AL204分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司；SuperVario-N多功能离心机 德国Funke Gerber公司；pro UV超纯水机 美国赛默飞世尔公司；DZKW-4电热恒温水浴锅 北京兴伟仪器有限公司；MS 3 basic涡旋振荡器、RVID旋转蒸发仪 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 试样制备

1.3.1.1 样品水解

准确称取固体和半固态样品2.0 g（精确至0.01 g，对于不同的样品称样量可适当调整，保证样品中脂肪质量不小于0.125 g）置于毛氏抽脂瓶中，加入8 mL水充分混合，再加入8 mL浓盐酸（12 mol/L）混匀；将雪糕样品整支融化后混匀为液体试样，称取均匀试样10.00 g置于毛氏抽脂瓶中，加入8 mL浓盐酸（12 mol/L）混匀。将上述毛氏抽脂瓶置于60～70 ℃水浴中，每隔5～10 min振摇1 次，约40～50 min，至试样完全水解，取出毛氏抽脂瓶，加入10 mL无水乙醇充分混合，冷却至室温。

1.3.1.2 脂肪提取

在毛氏抽脂瓶中加入25 mL乙醚，加塞振摇1 min，打开塞子，用适量的石油醚-乙醚溶液（体积比1∶1）冲洗瓶塞和瓶口附着的脂肪，600 r/min离心5 min或静置10 min，使乙醚层、水层分开，将上层有机相放入圆底烧瓶中；再加入25 mL乙醚，加塞振摇1 min，打开塞子，用适量的石油醚-乙醚溶液（体积比1∶1）冲洗瓶塞和瓶口附着的脂肪，600 r/min离心5 min或静置10 min，合并有机相于圆底烧瓶中，将全部有机相过适量的无水硫酸钠脱水，用少量石油醚-乙醚溶液（体积比1∶1）淋洗无水硫酸钠，收集全部流出液于100 mL容量瓶中，用乙醚定容并混匀。

精确移取上述定容液50 mL于恒质量的圆底烧瓶内，50 ℃水浴下旋转蒸去溶剂后，至（100±5） ℃干燥箱恒质量，计算样品中脂肪含量；另50 mL于50 ℃水浴下旋转蒸发去溶剂后，用于反式脂肪酸的甲酯化。

1.3.1.3 甲酯化

称取60 mg经1.3.1.2节步骤提取的脂肪（未经干燥箱干燥），置于10 mL具塞试管中，加入4 mL异辛烷充分溶解，加入0.2 mL 2 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液，涡旋混匀1 min，静置至澄清；加入1 g硫酸氢钠中和过量的氢氧化钾，涡旋混匀30 s，于4 000 r/min离心5 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为试样待测液。

1.3.2 仪器工作条件

SP-2560色谱柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm）；进样口温度250 ℃，分流进样，分流比1∶30；柱流速0.8 mL/min；进样体积1.0 μL；检测器温度280 ℃，载气：氮气；尾吹流量（氮气）25 mL/min；升温程序：初始温度120 ℃，保持0 min，以10 ℃/min的升温速率升至140 ℃，保持5 min，以1.3 ℃/min的升温速率升至240 ℃，保持4 min。

1.3.3 结果计算

1.3.3.1 试样中脂肪含量

式中：Cz为试样中脂肪含量/%；m1为圆底烧瓶和脂肪总质量/g；m0为圆底烧瓶质量/g；m2为试样质量/g；

1.3.3.2 脂肪中反式脂肪酸含量

反式脂肪酸以反式脂肪酸甲酯形式进行计算，反式脂肪酸甲酯相对含量按式（2）计算。

式中：Cx为归一化法计算得到的反式脂肪酸甲酯x相对含量/%；Ax为反式脂肪酸甲酯x峰面积；fx为反式脂肪酸甲酯x的校准因子，参考GB 5009.257—2016[21]；A为除去溶剂峰后所有峰校准面积的总和。

脂肪中反式脂肪酸含量按式（3）计算。

式中：Ct为脂肪中反式脂肪酸含量/%。

（2）参照《中药新药临床研究指导原则》评估疗效，计算出总有效率（A概率+B概率）。A（显效标准）：治疗后心功能改善幅度至少达到2级，并且心脏超声检查也改善明显；B（有效标准）：心功能在治疗后改善1级，心脏超声检查有一定的改善；C（无效标准）：未达到上述标准。

1.3.3.3 试样中反式脂肪酸含量

试样中反式脂肪酸含量按式（4）计算。

式中：C为试样中反式脂肪酸含量/%。

1.4 数据处理

采用Excel和Minitab软件对数据和图谱进行处理和绘制。

2 结果与分析

2.1 样品处理条件优化

参照GB 5009.257—2016方法进行样品的制备，酸水解是利用强酸破坏蛋白质、纤维素及结合态脂类，使脂肪游离；水解后加入无水乙醇可使蛋白质沉淀，降低表面张力，促进脂肪球聚合，同时溶解一些碳水化合物。所以浓盐酸和无水乙醇的加入量是提取脂肪的关键点，本研究对浓盐酸和无水乙醇的加入量进行优化。

2.1.1 浓盐酸加入量对反式脂肪酸测定值的影响

其他实验条件固定，向试样中分别加入5、8、10 mL浓盐酸，每组重复测定6 次，3 组反式脂肪酸测定结果平均值为0.11%、0.15%和0.15%。利用方差分析对测定结果进行差异性分析，由图1A可知，P=0＜0.05，说明加入5、8、10 mL浓盐酸的检测结果存在显著差异。由图1B可知，P=0.687＞0.05，说明加入8、10 mL浓盐酸检测结果没有显著差异。原因可能是，加入5 mL浓盐酸水解不完全，未能使脂肪完全游离出来，当加入8 mL或10 mL浓盐酸时，水解完全，脂肪全部游离出来。

图1 浓盐酸加入量对反式脂肪酸含量测定值的影响Fig. 1 Effect of the amount of hydrochloric acid on the measured content of trans fatty acids

2.1.2 无水乙醇加入量对反式脂肪酸测定值的影响

其他实验条件固定，分别加入无水乙醇5、10、15 mL，每组重复测定6 次，3 组反式脂肪酸测定结果平均值为0.11%、0.15%和0.15%。利用方差分析对测定结果进行差异性分析，由图2A可知，P=0＜0.05，说明加入无水乙醇5、10、15 mL的检测结果存在显著差异。由图2B可知，P=0.687＞0.05，说明加入无水乙醇10、15 mL检测结果没有显著差异。原因可能是，加入5 mL无水乙醇使蛋白质沉淀不完全，且乙醚不能将脂肪完全提取出来，当无水乙醇加入量为10 mL或15 mL时，均能使蛋白质沉淀完全，且乙醚能将脂肪完全提取出来。

图2 无水乙醇加入量对反式脂肪酸含量测定值的影响Fig. 2 Effect of the amount of anhydrous ethanol on the measured content of trans fatty acids

综上所述，在确保实验结果准确的前提下，选用试剂消耗量最少的条件，达到节约成本和保护环境的目的。因此，加入8 mL浓盐酸水解，水解后的样品加入10 mL无水乙醇为最佳条件。

2.2 色谱条件优化

2.2.1 色谱柱选择

色谱柱越长，则分离度越高。一般来说，15 m的短柱用于快速分离较简单的样品，也适用于扫描分析；30 m的色谱柱是最常用的柱长，大多数分析在此长度的柱子上完成；50、60、100 m的色谱柱用于分离比较复杂的样品。

由于雪糕中脂肪酸结构较为复杂，因此考虑采用100 m高极性色谱柱。对CP-Sil 88（100 m×0.25 mm，0.20 μm）与SP-2560（100 m×0.25 mm，0.20 μm）2 种色谱柱分离效果进行比较。当采用CP-Sil 88色谱柱时，反-9,12,15-十八碳三烯酸甲酯（C18:3n-9t,12t,15t）与花生酸甲酯（C20:0）重合为一个色谱峰。采用SP-2560色谱柱时，上述2 种物质得到了较好的分离。因此选用SP-2560毛细管色谱柱。

2.2.2 分离条件优化

2.2.2.1 程序升温速率的选择

为了得到更好的分离效果，固定色谱柱流速为0.8 mL/min，改变升温程序中第2阶段升温速率分别为0.8、1.3、1.5 ℃/min。由图3A可知，升温速率为0.8 ℃/min时，30号峰与31号峰未分离，无法进行定量计算；由图3B可知，升温速率升至1.3 ℃/min时，30号峰和31号峰均得到有效分离，能够进行定量计算；由图3C可知，随着升温速率继续升高，30号峰和31号峰出现部分重合，28号峰与29号峰也出现部分重合。程序升温速率为1.3 ℃/min为色谱峰有效分离的最优条件。

图3 不同升温速率的色谱图Fig. 3 Chromatograms with different heating rates

2.2.2.2 色谱柱流速的选择

确定最优的升温速率后，固定升温程序中升温速率为1.3 ℃/min，改变色谱柱流速分别为0.7、0.8、1.0、1.3 mL/min。由图4A可知，色谱柱流速为0.7 mL/min时，30号峰与31号峰存在部分重合现象，无法进行定量计算；由图4B可知，色谱柱流速为0.8 mL/min时，30号峰和31号峰均能实现分离，能够进行定量计算；由图4C可知，随着柱流速进一步增加到1.0 mL/min，30号峰和31号峰出现了部分重合现象；由图4D可知，色谱柱流速增加到1.3 mL/min时，30号峰和31号峰几乎重合。故色谱柱流速为0.8 mL/min是反式脂肪酸甲酯与顺式脂肪酸甲酯和饱和脂肪酸甲酯的色谱峰有效分离的最佳条件。

图4 不同色谱柱流速的色谱图Fig. 4 Chromatograms with different column velocities

2.3 标准溶液色谱图

确定最佳的色谱柱流速和程序升温条件，得到顺式脂肪酸、饱和脂肪酸和16 种反式脂肪酸混合标准溶液的色谱图，对应的色谱峰名称、分子简式和保留时间如表1所示。雪糕样品中脂肪酸甲酯色谱图如图5所示。

图5 雪糕脂肪酸甲酯色谱图Fig. 5 Chromatogram of fatty acid methyl esters in ice cream

表1 脂肪酸甲酯标准品色谱峰名称、分子简式和参考保留时间Table 1 Chromatographic peak names, molecular formulae and reference retention times of fatty acid methyl ester standards

续表1

由表1可知，反式脂肪酸甲酯与顺式脂肪酸甲酯和饱和脂肪酸甲酯的色谱峰均能有效分离，实现了51 种脂肪酸甲酯的基线分离，与GB 5009.257—2016中分别给出的反式脂肪酸甲酯和37 种脂肪酸甲酯标准品色谱图比较，该方法得到的标准溶液色谱图分离效果更佳。同时，脂肪酸甲酯的出峰顺序如下：1）相同碳原子的反式脂肪酸甲酯于顺式脂肪酸甲酯之前出峰；2）对于一烯酸甲酯，碳原子数越少出峰时间越早，随着碳原子数的增加，出峰时间推后；3）碳原子数相同的脂肪酸甲酯，一烯酸甲酯最先出峰，其次是二烯酸甲酯，最后是三烯酸甲酯；4）相同碳原子一烯酸甲酯，反式位号数越小出峰越早；全反式二烯酸甲酯和三烯酸甲酯的出峰时间早于含有顺式异构的脂肪酸甲酯。

2.4 方法重复性

分别对不同含量反式脂肪酸的雪糕进行6 次平行实验，得到反式脂肪酸含量的6 个平行值和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。由表2可知：雪糕1反式脂肪酸含量测定结果RSD为1.81%，雪糕2为1.11%，雪糕3为0.76%；根据GB/T 27417—2017的要求，被测组分含量为1%时，RSD≤2.7%，本实验结果RSD均小于2.7%，实验重复性符合要求。

表2 雪糕反式脂肪酸含量测定结果（n=6）Table 2 Results of determination of trans fatty acids in ice cream (n = 6)

2.5 方法正确性

Fapas14215能力验证样品在本研究中的测定结果为119%，准确值为94.9%，Z值为0.8，|Z|≤2为满意值，表明方法正确性符合要求。

2.6 检出限、定量限

雪糕1样品重复测定6 次，将雪糕1样品与雪糕10样品1∶1混合，重复测定6 次。由表3可知，雪糕1样品稀释1 倍重复测定6 次结果为均能检出，RSD为2.08%，根据GB/T 27417—2017的要求，被测组分含量为0.01%时，RSD≤5.3%，重复性符合要求，故0.011%可作为检出限。雪糕1样品重复测定6 次，测定结果平均值为0.020%，RSD为1.81%，重复性符合要求，故0.020%可作为定量限。

表3 定量限、检出限结果测定Table 3 Limit of detection and limit of quantification for actual samples

2.7 盲样结果

随机选取的10 种雪糕反式脂肪酸含量测定结果如表4所示。

表4 10 种雪糕反式脂肪酸含量测定结果Table 4 Contents of trans fatty acids in 10 commercial samples of ice cream

3 结 论

采用随机抽取的雪糕样品进行前处理条件、色谱条件优化，确定最佳前处理条件为加入8 mL浓盐酸和10 mL无水乙醇，经SP-2560毛细管柱分离，气相色谱仪FID检测，面积归一化法计算反式脂肪酸组分含量。结果表明，此方法具有较好的准确性和重复性，同时能够有效分离反式脂肪酸甲酯与顺式脂肪酸甲酯和饱和脂肪酸甲酯，提供了一种能准确测定雪糕中反式脂肪酸的检测方法。