自噬、炎症反应及免疫功能异常在急性胰腺炎中的研究进展

何昱静，温 雪，卢利霞，马 俊，于晓辉，张久聪

1.甘肃中医药大学第一临床医学院，甘肃 兰州 730000；2.中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院基础医学实验室，甘肃省干细胞与基因药物重点实验室；3.中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院消化内科

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一种与胰腺外分泌组织损伤和坏死相关的炎症性疾病，该病起病快、病情较重、多预后不良，其发病率为10%～20%。该病可不同程度地引起肺、肾、肝、心脏等重要实质脏器损伤，严重时可在疾病早期发生全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)、多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)甚至死亡。近年来，AP的发病率不断上升，死亡率高达30%[1]。AP常由胆石症、酒精滥用、高甘油三酯血症、药物、肥胖、致病基因变异、自身免疫、感染、手术并发症、代谢和/或内分泌失调等原因引起，前两者是AP发病机制的关键因素，其中胆石疾病是最常见的原因，其次是酒精；并且由于二者在发病地区和性别上的不同，造成其发病率相应不同，通常胆石症常见于女性，饮酒常见于男性[2]。但相关研究结果显示[3]，在我国，高甘油三酯血症是引起AP的最常见原因，其次是胆石症，酒精性AP患者相比前两者较少见。同时，最新的研究表明[4]，高甘油三酯血症相关性AP大鼠组与正常饮食AP大鼠相比，胰腺损伤、细胞凋亡更严重，自噬通量受阻，并且与内质网应激密切相关，提示高甘油三酯血症可加重AP。

1 自噬在AP中的作用

自噬是一种细胞涉及溶酶体降解并回收受损及有缺陷的细胞器、脂质和长寿蛋白的分解代谢过程，并维持内环境平衡和生物生长能量需要的几种途径的总称。自噬的类型因物质被运送到溶酶体方式的不同而不同。大自噬首先是携带特定序列基序的胞质蛋白与溶酶体上的受体结合，将必定要降解的物质隔离成双模结构的自噬体，自噬体来自于各种供体膜，包括内质网、高尔基复合体或质膜，然后与晚期核内体融合，最终与溶酶体融合并将降解物质送入溶酶体腔后形成单膜的自噬溶酶体，物质在其中被溶酶体水解酶降解[5]。由此产生的降解产物，如氨基酸和脂肪酸，通过转运体循环回到细胞质中。自噬体和自噬溶酶体的形成是自噬的关键步骤。自噬体的腔是中性的，不含水解酶，而自噬溶酶体的腔是酸性的，含有多种水解酶。上述步骤涉及自噬相关蛋白分级招募的Beclin-1和微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein light chain-3,LC3)多蛋白复合物的介导。微自噬是通过溶酶体直接吞噬小的细胞质成分介导的分泌小泡与溶酶体融合，并被溶酶体水解酶降解的过程[6]。但这一过程融合的机制仍不清楚。大自噬(以下简称自噬)是自噬在外分泌胰腺和胰腺炎中可被检查到的最常见的形式。自噬与炎症性疾病、癌症和神经退行性疾病等多种疾病的发病机制有关[7]。AP的诱发及其炎症反应可由自噬异常或功能紊乱诱导的胰蛋白酶原激活所致[8]。

自噬正常情况下是一种细胞存活防御机制，自噬通量(即自噬空泡的周转，从自噬小体的形成到自噬溶酶体的物质降解)是有效的，无空泡积累，此时自噬有助于维持体内细胞的稳态。在胰腺炎中，自噬受损主要表现为胰腺腺泡细胞内堆积含不良降解物质的自噬空泡，其可被认为是实验小鼠模型和人类AP的早期标志。自噬体形成增加和溶酶体降解减少之间的不平衡导致自噬通量受损。自噬溶酶体的积累表明溶酶体降解效率低下。上述发现均表明自噬通量的恢复、阻止腺泡细胞空泡化可降低胰腺炎的严重程度。

1.1 基础自噬在胰腺腺泡细胞中的功能基础自噬对维持胰腺腺泡细胞内稳态至关重要[9-10]。胰腺腺泡细胞自噬被激活或氧化应激诱导的自噬损伤被预防均可缓解胰腺炎的炎症反应和细胞死亡[11]。小鼠胰腺外分泌具有合成和转运蛋白质的强大功能，并且在饥饿反应时相比肝脏、肾脏、心脏和内分泌胰腺还具有较高的基础自噬水平，这些过程需要内质网、线粒体、高尔基体、溶酶体系统和酶原颗粒室的协调作用[12]。最近的研究表明，专门针对自噬或溶酶体途径的基因改变可导致胰腺损伤[13]。介导自噬体形成的自噬相关蛋白5(autophagy-related gene 5，ATG5)或ATG7或溶酶体功能的编码基因的破坏可导致胰腺自噬障碍或损伤，导致腺泡细胞严重变性、外分泌胰腺萎缩、纤维化和炎症[14]。驱动溶酶体发挥自噬功能的一个重要膜结构成分是溶酶体相关膜蛋白(lysosome-associated membrane protein，LAMP)，它可调节溶酶体与其他细胞器(特别是自噬体)的融合、溶酶体蛋白水解活性和吞噬作用。而缺乏LAMP基因或其被敲除的小鼠可发生自发性胰腺炎[15]，特别是LAMP-2，该胰腺炎由自噬通量受损引起的腺泡细胞空泡化开始，产生由溶酶体/自噬功能障碍最终引起的以胰蛋白酶原激活、巨噬细胞驱动的炎症和腺泡细胞死亡为特征的自发性胰腺炎。另外，ATG5、ATG7或介导自噬的转录因子TFEB和TFE3的基因敲除均可通过上述机制促进自发性胰腺炎的发生。TFEB介导的溶酶体生物合成受影响可能导致自噬功能不足，从而促进胰腺炎发生[16]。

1.2 线粒体功能障碍和内置网应激在溶酶体发生自噬过程中，伴随重要的细胞器反应是线粒体功能障碍和内置网应激[17]。当胰腺腺泡细胞内质网处理和消除错误折叠和/或未折叠等毒素蛋白的能力下降，内质网应激途径被激活，可导致其自身细胞凋亡[18]。在诸多组织器官中极易受内质网应激影响的是胰腺。在AP的驱动因素中内质网应激的驱动作用可被自噬作用阻止。相反，若自噬受损可促进胰腺炎的进展。表明胰腺中自噬和内质网、线粒体稳态之间存在交叉调节。自噬受雷帕霉素机制靶点和腺苷单磷酸激酶信号的调控。因此，靶向线粒体、内质网、自噬体及自噬溶酶体细胞器途径以恢复腺泡细胞有效自噬可作为维持腺泡细胞稳态和治疗AP的一个重要途径。

1.3 选择性和非选择性自噬自噬有选择性和非选择性。营养缺乏引起的自噬是非选择性；选择性自噬是通过降解细胞成分上的特定受体启动的，p62就是一种多结构域蛋白受体，作为多聚泛素化蛋白的信号支架和伴侣，它调节自噬和氧化应激等多种细胞过程[19-20]。p62通过自噬特异性降解，正常情况下保持在低水平，过度的自噬空泡和p62累积(特别是与LC3-Ⅱ一起)是自噬通量受损的标志。LC3是哺乳动物酵母ATG8的同源物，其胞质形态(LC3-Ⅰ)被脂化为LC3-Ⅱ。在正常组织中，选择性自噬和非选择性自噬共存，维持细胞内稳态，选择性自噬具有抗疾病作用。

1.4 miRNA的调节miRNA是一类高度进化保守的单链核苷酸，其表达障碍可导致炎症浸润，在包括胰腺炎在内的多种疾病免疫应答的发生机制中发挥关键的调节作用[21]。此外，鉴于miRNA的稳定性和易检测性特征，其可作为AP患者临床上潜在的生物学标志物，对早期诊断AP及其预后和治疗干预具有较高的灵敏性和特异性[22]。腺泡细胞、巨噬细胞和淋巴细胞中miRNA的异常可通过调节腺泡细胞的凋亡和坏死、局部和全身炎症反应而促进AP的发生发展[23]。研究发现miR-19b在AP中的过度表达可能通过调节靶向基因的编码而促进胰腺腺泡细胞坏死和凋亡，有助于AP的发生[24]。另外，miR-375可以通过靶向调节ATG7抑制自噬并促进AP腺泡细胞的炎症反应和凋亡[25]。并且ATG7在胰腺腺泡细胞中的缺失可导致AP腺泡细胞的凋亡[26]。研究发现miR-148的直接靶点是IL-6，其表达上调可降低IL-6的水平，同时可降低自噬小体和自噬溶酶体的量以改善AP[27]。上述结果提示miRNA有望成为AP基因治疗的候选基因。

2 炎症反应及免疫功能异常

近年来，免疫细胞及其产物免疫分子受到广泛关注，尤其是单核细胞不同表型的极化和功能状态在调节AP发生发展中起重要作用，如M1单核细胞通过释放促炎细胞因子促进炎症反应，而M2单核细胞主要产生控制炎症、防止组织过度破坏及促进组织修复的抗炎分子[28]。单核细胞被坏死腺泡细胞释放的细胞内容物介质，即损伤相关分子模式(danger associated molecular pattern，DAMP)所活化。DAMP通过与免疫细胞上的不同受体结合来介导发挥激活炎症和刺激免疫反应的作用，其对AP的发生机制具有促进作用。例如，晚期炎症介质高迁移率族蛋白1(high-mobility group box-1，HMGB1)与Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)结合[29]激活NF-κB通路后，调节免疫细胞炎症介质的基因表达水平，释放细胞因子、黏附分子和氧自由基[30]，加重胰腺组织炎症反应。循环中HMGB1水平与AP的严重程度相关，细胞外HMGB1增加AP严重程度[31]，而细胞内HMGB1限制炎症反应和组织损伤。研究发现，HMGB1可通过TLR2和TLR4介导的NF-κB信号通路诱导M1单核细胞的极化状态，参与炎症反应过程[32]。此外，上述物质参与毛细血管渗漏、肠道缺血、细菌移位和肺泡损伤，参与AP局部炎症进展到全身性炎症反应的过程。上述过程的持续作用是AP逐步进展的特点，在此期间，机体免疫系统下调，肠道细菌移位加重胰腺周围组织感染，从而导致败血症和多脏器功能衰竭，增加AP患者的死亡率。

AP最早的免疫反应发生于自身腺泡细胞，其受损后释放的趋化因子和细胞因子以及各种黏附分子募集并介导外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)进入胰腺损伤部位，活化的PBMCs是全身炎症和加重AP组织损伤的关键细胞，在这些趋化因子中，单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP1)促进炎性单核细胞的运输，巨噬细胞炎性蛋白2α(macrophage inflammatory protein 2α，MIP2α)和CXC趋化因子配体1(C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1)招募中性粒细胞，中性粒细胞是第一批被招募到胰腺和肺的免疫细胞[33]。活化的中性粒细胞和PBMCs进入全身循环后又可分泌包括白细胞介素-1和白细胞介素6(IL-1和IL-6)及细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecules-1，ICAM-1)等促炎和趋化因子，攻击腺泡细胞，使胰腺和胰外多器官炎症加重，放大炎症级联反应，早期发生SIRS或MODS[34]。中性粒细胞还会产生由颗粒蛋白、DNA和组蛋白组成的中性粒细胞胞外黏附网[35-36]，使胰腺导管阻塞，激活促炎信号，并提前激活胰蛋白酶原。炎症反应的有效发生和结局以及组织稳态的恢复依赖于炎症介质招募到胰腺炎症部位的中性粒细胞、巨噬细胞和其他类型免疫细胞间的相互协调作用。因此，抑制免疫细胞及其免疫分子可以防止胰腺和远隔器官的损伤。

2.1 炎症转录因子的激活目前研究转录因子，如NF-κB、信号传导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的范围较广，它们在炎症反应过程中调节免疫细胞的活性及其细胞因子的产生。腺泡细胞NF-κB的激活触发TNF-α、IL-6、IL-1β、髓过氧化物酶、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，INOS)和ICAM-1这些与AP相关促炎介质的表达上调，同时招募白细胞到胰腺和远隔器官诱导炎症反应过程，使胰腺自身和周围组织损伤和破坏，进一步加重AP进展[37]。NF-κB还具有调节细胞增殖和凋亡的功能[38]。其调节可影响AP胰腺和肠道损伤的严重程度[39]。NF-κB包含Rel家族成员的同型二聚体和异型二聚体，并被细胞因子、脂多糖、氧化应激和蛋白激酶C的激活剂激活[40]。然而，腹腔巨噬细胞表面蛋白Tim-3表达的下调通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路以介导炎症细胞因子释放来加重胰腺组织损伤[41]。在腺泡细胞中，NF-κB通路的激活可同时诱导促炎和抗炎信号通路以增加或降低胰腺炎的严重性，这取决于激活该通路的方法，但阐明其机制仍需进一步研究。

NF-κB在炎症开始时被激活，但STAT3的磷酸化和易位发生在后期，并将局部损伤与多器官衰竭联系起来。STAT3介导炎症通路，并调节胰腺炎的发展过程[42]，其特异性地下调或失活缓解AP的严重程度[43-44]。而STAT3的线粒体易位可抑制由氧化应激诱导的自噬，并且可以有效地保护线粒体免于被线粒体自噬降解[45]。该通路的抑制剂可以改善胰腺炎及其并发症的严重程度[46-47]，因此，抑制STAT3活性可能是缓解AP进展的潜在靶点。

2.2 肠道菌群失调肠黏膜损伤及其随后释放的内毒素和促炎细胞因子(如IL-1β和IL-18)可能在重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)导致的多器官功能障碍中起重要作用，甚至是SAP患者潜在的致死原因[48]。SAP发生急性肺损伤可能与自噬水平降低引起的细菌易位有关[49]。有报道称，SAP大鼠引起的肠黏膜屏障损伤可由高脂饮食引起的炎症反应、氧化应激等机制引起[50]。Wan等[51]研究p38 MAPK抑制剂SB203580对大鼠SAP模型肠道炎症和肠道菌群失调的作用时发现：(1)肠道菌群失调在SAP的发病机制中起重要作用。(2)胰腺及回肠远端水肿和炎性浸润的SAP模型大鼠血浆和回肠远端TNF-α、IL-6和IL-1β的表达经SB203580治疗后降低。(3)SAP组的细菌多样性及数量明显降低，而SAP+SB203580组的细菌多样性高、肠道菌群比例更正常。(4)SB203580通过抑制p38 MAPK信号通路减少肠道炎症反应和微生物菌群失调。研究发现，血清中促炎因子的消除可降低ROCK(Rho激酶)mRNA的表达来改善SAP合并MODS患者的肠黏膜屏障功能障碍[52]。肠道内菌群失调，如大肠杆菌数量显著增加与急性坏死性胰腺炎胰腺损伤和肠屏障功能障碍有关[53]。肠黏膜屏障功能受损后使其通透性增加，细菌、毒素和炎症因子可通过渗入黏膜随肠道淋巴管引流进入全身体循环，进而形成脓毒症，引起胰腺等多脏器损伤。

3 总结

自噬障碍和持续炎症反应会促进胰腺炎的发展。腺泡细胞自噬紊乱与疾病的开始有关，而AP的严重程度主要取决于炎症反应是否消退或增强。基于AP患者的临床现实情况，全面了解AP的发生机制对早期临床医师规范、有效治疗该病具有重要的指导意义。然而，要完全明确自噬、炎症反应及免疫功能异常在AP的发生机制还需进行更多的相关研究。而充分认识上述机制在AP发病机制中的作用是针对AP潜在治疗靶点和靶点途径的关键步骤，这对于AP的诊断、临床严重程度和治疗起到积极有效的参考作用，对早期评估病情和预后发挥重要的临床意义，以此为临床有效治疗该病提供现实依据。