茵芩合剂质量标准研究

欧人豪 曾 金 韦祖巧 李 萍

广西壮族自治区柳州市妇幼保健院（柳州市妇产医院、柳州市儿童医院）药学部，广西柳州 545001

茵芩合剂为广西壮族自治区柳州市妇幼保健院在研制剂，由绵茵陈、黄芩、熟大黄、甘草四味中药按传统工艺制得，具有清热利湿、退黄作用，主要用于防治新生儿黄疸。处方中绵茵陈、黄芩分别为君药和臣药，熟大黄为佐药，甘草为使药。绿原酸、咖啡酸均为绵茵陈的活性成分[1-2]，绿原酸具有保肝利胆、清除自由基等作用[3]，咖啡酸也具有一定的抗氧化、抗炎等保肝作用[4]；黄芩苷、黄芩素为黄芩的主要有效成分[5]，具有抗菌[6]、抗炎、抗氧化[7－9]和保肝利胆[10－11]等作用。为控制制剂质量，本研究采用微乳薄层色谱法对其中绵茵陈、黄芩和熟大黄同时进行鉴别，采用高效液相色谱法梯度洗脱对绿原酸、咖啡酸、黄芩苷和黄芩素同时测定，建立简便可行的质量控制方法。

1 材料

1.1 仪器

LC-20A 高效液相色谱仪（日本岛津）；ZF-1 三用紫外分析仪（上海精科实业有限公司）；FA1004 电子分析天平（上海天平仪器厂）；KQ-300DE 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TDZ4-WS 台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；HH-6 数显恒温水浴锅（江苏金坛市环宇科学仪器厂）；聚酰胺薄膜（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）。

1.2 试药

绿原酸（批号：110753-201716）、大黄素（批号：110756-201512）对照品购于中国食品药品检定研究院；黄芩苷（批号：AF20022601）、黄芩素（批号：AF906 1605）、咖啡酸（批号：AF9060905）对照品购于成都埃法生物科技有限公司；绵茵陈（批号：121555-201602）、黄芩（批号：120955-201309）、大黄（批号：120984-201202）对照药材购于中国食品药品检定研究院；绵茵陈（批号：20190519）、黄芩（批号：20190817）、熟大黄（批号：20190609）、甘草（批号：20190824）购于广西柳州百草堂药业有限公司中药饮片厂；茵芩合剂为广西壮族自治区柳州市妇幼保健院制剂室自制。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 溶液制备

2.1.1.1 供试品1 溶液 取样品10 ml，3500 r/min 离心5 min，取其上清液在水浴中蒸干，残渣加甲醇适量溶解即得。

2.1.1.2 供试品2 溶液 取样品10 ml，3500 r/min 离心5 min，取其上清液，乙酸乙酯萃取2 次（10 ml/次），萃取液在水浴中蒸干，残渣加甲醇适量溶解即得。

2.1.1.3 对照药材溶液 分别取绵茵陈1 g、黄芩0.2 g、大黄0.5 g，加甲醇20 ml，超声，滤过，滤液在水浴中蒸干至适量，得各对照药材溶液。

2.1.1.4 对照品溶液 称取绿原酸、黄芩苷和大黄素等标准品各1.0 mg，分别加甲醇5 ml 溶解，得各对照品溶液（质量浓度均为0.2 mg/ml）。

2.1.1.5 阴性对照溶液 按处方比例称取缺黄芩的各味药材，照制剂制备工艺制得黄芩阴性样品，同法分别制得绵茵陈和大黄阴性样品。按“2.1.1.1”项下方法制得绵茵陈和黄芩阴性对照溶液；按“2.1.1.2”项下方法制得大黄阴性对照溶液。

2.1.2 微乳液制备

按质量比称取十二烷基硫酸钠∶正丁醇∶环已烷∶水=2.7∶6.3∶1.0∶30.0，超声10 min，静置24 h 备用。

2.1.3 薄层层析

取“2.1.1”项下各溶液约3 μl，分别点样于聚酰胺薄膜板上，取微乳液适量，按体积比9∶1 加入甲酸作为展开剂，展开7.0 cm，取出晾干。大黄素及其他大黄成分在日光下显黄色斑点；置紫外线（365 nm）下绿原酸显蓝紫色荧光斑点；喷以1%三氯化铁乙醇溶液，日光下黄芩苷显墨绿色斑点。结果显示供试品色谱中显示有与对照药材和对照品位置和颜色相同的斑点，而各阴性对照无干扰。见图1～3。

图1 茵芩合剂中绵茵陈薄层色谱图

图2 茵芩合剂中黄芩薄层色谱图

图3 茵芩合剂中大黄薄层色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

Diamonsil C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈（A）-0.25%磷酸水溶液（B），梯度洗脱；流速1.0 ml/min；波长310 nm；柱温30℃；进样量20 μl。梯度洗脱程序：0 min，10%A；0～25 min，10%→35%A；25～35 min，35%→55%A；35～40 min，55%→10%A。

2.2.2 溶液制备

2.2.2.1 混合对照品溶液 取绿原酸、咖啡酸、黄芩素各适量，精密称定，分别置容量瓶中，加50%甲醇制成浓度分别为绿原酸2.980 mg/ml、咖啡酸0.300 mg/ml和黄芩素0.248 mg/ml 的单一对照品贮备液；另取黄芩苷适量，精密称定，置容量瓶中，以含1.0 μmol/L 氢氧化钠的50%甲醇（pH 值约为6.0）制成0.510 mg/ml的黄芩苷贮备液。取以上各贮备液于50 ml 容量瓶中，加50%甲醇（不含碱）制成绿原酸、咖啡酸、黄芩苷和黄芩素浓度分别为59.60、6.00、408.00、19.84 μg/ml的混合对照品溶液。

2.2.2.2 供试品溶液 取茵芩合剂0.25 ml 于25 ml 容量瓶中，50%甲醇定容，密塞，超声10 min，3600 r/min离心10 min，取上清液，即得。

2.2.2.3 阴性对照溶液 按处方比例分别制备缺茵陈和黄芩的阴性对照样品，再按“2.2.2.2”项下方法制得绵茵陈阴性样品溶液和黄芩阴性样品溶液。

2.2.3 专属性考察

取“2.2.2”项下的混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，分别进样。结果显示，四种检测成分的色谱峰分离度较好，其他成分对测定无干扰。见图4。

图4 高效液相色谱图

2.2.4 线性关系考察

分别精密量取混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml 至5 ml 容量瓶中，以50%甲醇定容，制成系列混合对照品溶液，进样。以对照品浓度（X）为横坐标，峰面积的1/1000（Y）为纵坐标，进行线性回归，结果见表1。

表1 线性关系考察结果

2.2.5 精密度试验

取同一浓度供试品溶液，连续进样6 次，结果显示绿原酸、咖啡酸、黄芩苷和黄芩素峰面积的平均RSD 分别为0.25%、1.29%、0.10%和1.00%，提示仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验

取同一浓度供试品溶液，置室温下，分别于0、2、4、8、12 h 进样测定峰面积，结果显示绿原酸、咖啡酸、黄芩苷和黄芩素12 h 内峰面积的平均RSD 分别为0.42%、1.36%、0.23%和2.49%，提示供试品溶液在室温放置12 h 内稳定性较好。

2.2.7 重复性试验

取同批次茵芩合剂6 份（批号：201021），按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，进样，结果显示绿原酸、咖啡酸、黄芩苷和黄芩素的峰面积的平均RSD 分别为1.94%、2.10%、1.72%和2.22%，提示该方法重复性较好。

2.2.8 加样回收率试验

精密量取同批次已知含量样品6 份（批号：201021），每份0.25 ml，分别置于50 ml 容量瓶中，每份加入绿原酸对照品贮备液160 μl、咖啡酸对照品贮备液120 μl、黄芩素对照品贮备液400 μl 和黄芩苷对照品贮备液7.20 ml，以50%甲醇定容，余下操作同“2.2.2”项下方法，进样，结果见表2。

表2 茵芩合剂4 种成分加样回收试验结果（n=6）

2.2.9 样品含量测定

取3 批茵芩合剂样品，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样，结果见表3。

表3 3 批茵芩合剂样品含量检测结果（mg/ml）

3 讨论

微乳液为微乳薄层色谱展开剂，是由表面活性剂、助表面活性剂、油和水按适当比例自发形成的澄清透明、各向同性、低黏度的热力学稳定体系[12]，为达到最佳效果，必要时可加入一些改性剂如甲酸[13-14]、丙酮等[15]。微乳薄层色谱可用于鉴别黄酮类[13,16]、有机酸类、醌类[15]、酚类[17]等中药有效成分，具有分离成分多，特别是对结构类似的化合物也能很好分离的特点。本研究使用该方法同时鉴别茵陈、黄芩和大黄3 种成分，样品处理简单，较传统薄层色谱鉴别方法[18-20]可节省时间和试剂成本。

前期研究发现，配制含量测定所需的对照品溶液时，使用50%甲醇比100%或70%甲醇效果好，绿原酸峰形对称，无肩峰出现。另外，由于黄芩苷在中药材或中药制剂中以镁盐的形式存在[21]，其醇溶性和水溶性均较好，而黄芩苷对照品未成盐，难溶于甲醇，几乎不溶于水[22]。增加黄芩苷的方法有多种[23-24]，本研究在甲醇水溶液中加入微量氢氧化钠使黄芩苷成钠盐，使其完全溶解，经考察所配制的对照品溶液在20℃左右放置12 h 或在2～8℃放置4 d 黄芩苷和其他成分含量下降只有1%左右，说明加入微量氢氧化钠对各目标成分的测定结果无明显影响。

本研究采用梯度洗脱法测定绿原酸、咖啡酸、黄芩苷和黄芩素，方法简单，重复性好，相较于以往类似处方制剂的有效成分含量测定[19-20,25]，具有检测有效成分更多，更节约成本的优势，可用于优化类似处方制剂的质量控制。