朱春雪 何嫣婕 何美娟 刘 晴 刘承雨 王一成 黄汉鹏
江苏大学附属医院呼吸与危重症医学科,江苏镇江 212000
病毒感染细胞后,Toll 样受体3(Toll-like receptor 3,TLR3)特异性识别病毒双链核糖核酸,激发炎症因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)等转录,出现炎症级联反应[1-3];诱发内质网应激反应,导致相关基因如肌醇需求酶-1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)、拼接型X 盒子结合蛋白1(spliced X-box binding protein 1,xBP1s)、C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)等增加,引起或加重炎症、细胞自噬及凋亡[4-8]。
中药苦金片清热利咽、消肿止痛,但抗病毒作用鲜见报道。本研究采用病毒类似物Poly(I∶C)感染巨噬细胞体外模拟活病毒感染[9-10],观察苦金片对感染过程中炎症因子、内质网应激反应相关基因及抗病毒因子如干扰素调节因子-3(interferon regulatory factor-3,IRF-3)、β 干扰素(interferon-β,IFN-β)、干扰素刺激基因15(interferon stimulated gene 15,ISG15)、寡腺苷酸合成酶1(oligoadenylate synthetase 1,OAS1)、黏病毒耐药蛋白1(myxovirus resistance 1,MX1)的影响。
小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)(上海酶研科技有限公司);Poly(I∶C)(APExBIO 公司,货号:B5551313 377BD);高糖DMEM 培养基、胎牛血清(Gibco 公司,货号:8120281、42F335);RNA 逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR 试剂盒(TaKaRa 公司,批号:AJG2280A、AI80465A);BCA 试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,生产批号:No.090120201103);GAPDH、caspase-3、IL-6、TNF-α、TGF-β、xBP1s 兔抗鼠多克隆抗体(CST公司,货号:#9662、#2118、#12912、#11948、#3711、#40435);CCK-8 试剂盒(东仁化学研究所,批号:FH783);苦金片(上海医药集团青岛国风药业股份有限公司,批号:151003)。
1.2.1 溶液制备 苦金片溶液:适量苦金片置磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered solution,PBS),59℃水浴5 h,室温下,以离心半径20 cm,3500 r/min 离心10 min,过滤,配成100 mg/ml 溶液,4℃保存。
Poly(I∶C)溶液:适量Poly(I∶C)溶于PBS 制成10 mg/ml 溶液,-20℃保存。
1.2.2 细胞培养 RAW264.7 细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM 中,37℃、5%CO2孵箱(Thermo 公司,150i 型)培养。
1.2.3 CCK-8 法检测RAW264.7 细胞活力 RAW264.7细胞按104个细胞/孔密度接种于96 孔板。为观察浓度对细胞的影响,设立苦金片不同浓度组(1、2、5 mg/ml)、空白组、对照组(加入等量培养基)、Poly(I∶C)(20 μg/ml)组,实验重复5 次,每100 μl 培养基加10 μl CCK-8孵育2 h,酶标仪(Thermo 公司,fc 型)检测450 nm 光密度(optical density,OD)值,细胞活性(%)=(给药组OD 值-空白组OD 值)/(对照组OD 值-空白组OD 值)×100%。
1.2.4 细胞分组 RAW264.7 细胞接种于6 孔板并分为三组:对照组、Poly(I∶C)组与苦金片组(1 mg/ml),实验重复5 次。Poly(I∶C)组予Poly(I∶C)(20 μg/mL)刺激12 h,苦金片组在Poly(I∶C)刺激后,吸去上清,洗涤后予苦金片(1 mg/ml)刺激6 h,对照组不予特殊处理。
1.2.5 实时荧光定量聚合酶链反应 Trizol 试剂提取对照组、Poly(I∶C)组、苦金片组(1 mg/ml)细胞总RNA,逆转录为cDNA,PCR 反应条件:预变性95℃,30 s,1 个循环;95℃,5 s,40 个循环。引物序列(上海生工生物科技有限公司)见表1。将值标准化为Tublin 表达,结果用2-ΔΔCt表示。
表1 引物序列
1.2.6 蛋白质免疫印迹法 对照组、Poly(I∶C)组、苦金片组(1 mg/ml)细胞充分裂解后离心,收集总蛋白,加热变性后取20 μg 蛋白上样,凝胶电泳(80 V 30 min,110 V 1 h)后湿转到PVDF 膜(300 mA,2 h),室温封闭1.5 h,分别用GAPDH 抗体、IL-6 抗体、TNF-α 抗体、caspase-3 抗体、xBP1s 抗体1∶1000 稀释后4℃摇床孵育过夜(GAPDH 为内参)。清洗后与HRP 标记羊抗兔二抗(1∶100)室温孵育1.5 h,清洗曝光,Image J软件分析灰度。
采用Graphpad Prism 对结果作图并进行统计学分析,计量数据以均数±标准差()表示,比较采用t 检验。以P <0.05 为差异有统计学意义。
Poly(I∶C)组细胞活力低于对照组,差异有统计学意义(P <0.05);苦金片不同浓度组高于Poly(I∶C)组,差异统计学意义(P <0.05)。苦金片不同浓度组比较,差异无统计学意义(P >0.05),后续实验中苦金片浓度选择1 mg/ml。见图1。
图1 苦金片对Poly(I∶C)刺激下巨噬细胞活力的影响(n=5)
Poly(I∶C)组TLR3、IRF3、IFN-β、ISG15、OAS1、MX1,IL-6、TNF-α、TGF-β,IRE1α,xBP1s,CHOP mRNA表达高于对照组,差异有统计学意义(P <0.05 或P <0.01);与Poly(I∶C)组比较,苦金片组TLR3、IRF3、IFNβ、ISG15、OAS1、MX1 mRNA 表达上调,IL-6、TNF-α、TGF-β、IRE1α、xBP1s、CHOP mRNA 表达下调,差异有统计学意义(P <0.05 或P <0.01)。见图2。
图2 苦金片对Poly(I∶C)刺激下相关因子mRNA 表达的影响(n=5)
Poly(I∶C)组IL-6、TNF-α、xBP1s、caspase-3 蛋白表达高于对照组,差异有高度统计学意义(P <0.01);苦金片组IL-6、TNF-α、xBP1s、caspase-3 蛋白表达低于Poly(I∶C)组,差异有统计学意义(P <0.05)。见图3。
图3 苦金片对Poly(I∶C)刺激下相关因子蛋白表达的影响(n=5)
呼吸道病毒可引起病毒性呼吸道疾病,临床发病率高[11-12],探索有效的治疗临床意义重大。中药作为我国传统治疗药物,其中也存在多种抗病毒药物[13-16]。苦金片由苦地丁、金银花、黄芩、牛蒡子、桔梗、玄参、甘草组成,其中苦地丁生物碱可抗炎[17];金银花中绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸-A 等可拮抗流感病毒[18-19];黄芩苷[20]、牛蒡子苷、牛蒡子苷元[21]等均有抗病毒功效。因此,笔者以Poly(I∶C)体外刺激巨噬细胞模拟病毒感染过程,探索苦金片的抗病毒作用。
TLR3 与配体结合活化会进一步激活IRF3、IFN-β等表达,诱导天然抗病毒反应[22-23]。本实验显示,经Poly(I∶C)孵育的巨噬细胞TLR3、IRF3、IFN-β、ISG15、OAS1、Mx1 mRNA 表达升高,表明Poly(I∶C)可诱导巨噬细胞的抗病毒反应;苦金片组TLR3、IRF3、IFN-β、ISG15、OAS1、Mx1 mRNA 高于Poly(I∶C)组,提示药物增强了细胞的抗病毒反应。
另一方面,病毒感染后建立的天然抗病毒信号也能诱导促炎性细胞因子表达,炎症因子释放过多会加速细胞溶解或凋亡[24]。本实验也发现与对照组比较,Poly(I∶C)处理后IL-6、TNF-α、TGF-β、caspase-3 表达增加,表明Poly(I∶C)诱导了严重的炎症反应,加速了巨噬细胞凋亡,苦金片组IL-6、TNF-α、xBP1s、caspase-3 蛋白表达低于Poly(I∶C)组,提示苦金片可在一定程度逆转上述作用。
病毒感染后,大量病毒蛋白在内质网合成中使内质网处于应激状态,一旦超过内质网负荷能力,细胞凋亡信号通路便被激活[25]。实验发现,与对照组比较,Poly(I∶C)处理后内质网应激相关基因IRE1α、xBP1s、CHOP mRNA 表达升高,与Poly(I∶C)组比较,苦金片组IRE1α、xBP1s、CHOP mRNA 表达下调,提示内质网应激被过度激活,苦金片可明显减轻了这种应激状态。
综上,苦金片通过上调抗病毒基因表达、抑制炎症介质释放和内质网的过度应激,减少细胞凋亡,提高细胞存活率,提示苦金片具有抗病毒疗效,为其临床应用提供新的依据。