医用一次性防护服微生物指标检验方法的研究与探讨

孙明波 董健 陶烨 陈文博 蔡盼盼 刘浩 付新 杜春淼 余洋＊

1 辽宁省检验检测认证中心 （辽宁 沈阳 110171）

2 辽宁钴源辐照中心 （辽宁 沈阳 110000）

内容提要：目的：尝试用薄膜过滤检查法对医用一次性防护服微生物指标中的菌落计数进行方法学验证，并用建立的新方法与平皿法进行对比。方法：根据《中华人民共和国药典》2015年版四部，通过3次独立的平行试验，分别计算各试验菌每次试验的回收率。结果：在对需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数方法验证的3次独立平行试验中，供试品组的菌回收率均在50%～200%，故可根据此方法进行医用一次性防护服菌落总数的测定。通过对32批产品进行微生物指标考察，分别采用薄膜过滤法和平皿法对其菌落计数进行比较，其合格率均为96.9%，无明显差异，但由于薄膜过滤取样量大，且所用培养基灵敏度更高，故所得菌数精准度较高。结论：通过方法学验证说明建立的微生物指标检查方法适用于医用一次性防护服的微生物指标检查，保证微生物指标检查的准确性和有效性。

医用防护服可以在使用者进入疫情重区、接触感染区域人群时保护他们免遭病毒污染感染，避免交叉感染，在抗击新冠疫情防护工作中起到了至关重要的作用。其作为医务工作者的必需品，在疫情期间起到了阻隔细菌与病毒、有害超细粉尘、酸碱性溶液等作用，同时能够保证疫区、感染区域等环境的清洁[1]。微生物指标作为医用一次性防护服标准的一项重要指标，目前其检验方法引自GB15979-2002[2]，即制备的1:20供试液直接采用平皿法进行菌落计数，由于近几年医疗器械的微生物限度检验方法多与药典相关，且国标中所用计数培养基与药典有差异，故本文结合执行2015年版《中国药典》，尝试建立了医用一次性防护服微生物指标薄膜过滤检查的方法，并用建立的新方法与GB15979-2002中的平皿法进行比较。

1.材料与方法

1.1 一般材料

实验时间：2020年8月～2021年1月。供试品：医用一次性防护服A（SMMS无纺布复合材料），由企业提供；医用一次性防护服B（PE复合材料），由企业提供。

实验菌种：金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]均来自中国药品生物制品检定研究院医学菌种保藏中心。

培养基及试剂：胰酪大豆胨琼脂（Merck公司）、沙氏葡萄糖琼脂（Merck公司，用于药品中霉菌、酵母菌总数的测定）、沙氏琼脂（含氯霉素）（北京陆桥技术股份有限公司，用于一次性卫生用品中真菌菌落总数的测定），营养琼脂（广东环凯微生物科技有限公司），胰酪大豆胨液体培养基（Merck公司），0.9%无菌氯化钠溶液（辽宁民康制药有限公司），吐温80（天津市富宇精细化工有限公司）。

仪器设备：集菌仪（HTY-2000A）（杭州高得医疗器械有限公司）；薄膜过滤器（杭州泰林生物技术设备有限公司）；生物安全柜（HFsafe-1500LC）（上海力申科学仪器有限公司）；电子天平（XP2003S DR）（梅特勒-托利多仪器有限公司）；浊度计（Densicheck Plus）（梅里埃公司）；全自动立式灭菌锅（LMQ.C-80C）（山东新华医疗器械股份有限公司）；多用生化培养箱（SP-530）（沈阳市伟明医疗设备厂）。

1.2 方法

1.2.1 供试液制备

分别取两种材质的防护服，用无菌方法打开3个包装，每包取样，准确称取10.0g样品，剪碎，加入到200mL生理盐水中，充分混匀，成为1:20供试液。

1.2.2 菌液制备[3]

取枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至0～100CFU/mL的菌悬液。取黑曲霉新鲜培养物，加入5mL含0.05%吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液，洗下黑曲霉孢子后，用含0.05%吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释至含菌数0～100CFU/mL的菌悬液。

1.2.3 菌落计数验证试验

需氧菌总数：试验组：分别取1:20供试液20mL，加到100mL0.9%无菌氯化钠溶液中，薄膜过滤，冲洗液为0.9%无菌氯化钠溶液，分两次冲洗，每次100mL，在最后一次冲洗液中分别加入1mL（＜100CFU）铜绿假单胞菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。取出滤膜，贴于TSA培养基平板上，置33°C培养箱中培养3d。

霉菌和酵母菌总数：试验组：分别取1:20供试液20mL，加到100mL 0.9%无菌氯化钠溶液中，薄膜过滤冲洗液为0.9%无菌氯化钠溶液，分两次冲洗，每次100mL，在最后一次冲洗液中分别加入1mL（＜100CFU）黑曲霉菌、白色念珠菌。取出滤膜，贴于SDA培养基平板上，置23°C培养箱中培养5d。

菌液组：以稀释液0.9%无菌氯化钠溶液替代供试液，按试验组操作加入菌液，方法同试验组。

供试品对照组：取制备好的供试液，以稀释液0.9%无菌氯化钠溶液代替菌液同试验组操作。

阴性对照组：取稀释液0.9%无菌氯化钠溶液20mL，按试验组操作。

回收率=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液组菌落数×100%。所有验证均进行三次独立的平行试验。

1.2.4 检验方法

选取32批次防护服，分别用新建薄膜过滤法以及国标中的平皿法进行检验。

1.2.4.1 采用药典中薄膜过滤法进行菌落计数

取1:20供试液20mL，加到100mL0.9%无菌氯化钠溶液中，薄膜过滤，用0.9%无菌氯化钠溶液200mL分次冲洗，每次100mL，取出滤膜，菌面朝上贴于TSA、SDA培养基平板上，分别置33°C培养箱中培养5d，23°C培养箱中培养7d，观察结果。

1.2.4.2 采用国标中平皿法进行菌落计数

取1:20供试液接种到5个平皿中，每个平皿中加入1mL样液，然后用冷却至45°C左右的熔化的营养琼脂培养基、沙氏琼脂培养基倒入每个平皿内混合均匀，琼脂凝固后翻转平皿，分别置33°C培养箱中培养48h，23°C培养箱中培养7d，观察结果。按公式（1）进行计算。

注：X——菌落总数（CFU/g）；B——5块培养基平板上的菌落总数；K——稀释度。

2.结果

菌落计数及回收率测定三次独立的平行试验结果见表1，样品菌落计数结果见表2，新建菌落计数方法及平皿法的检验结果见表3。

表1.菌落计数及回收率测定三次试验结果

表2.样品菌落计数结果

表3.两种方法的检验结果的比较

3.讨论

菌落计数是监测防护用品是否被微生物污染，国家标准中非无菌产品的重要检测项目，同时也是无菌产品灭菌前的一项重要指标。目前采用国标法，此法较规范、正确，但由于其使用的方法为1:20供试液直接采用平皿法进行菌落计数，且计数培养基与2015年版《中国药典》有所不同，故本文结合执行2015年版《中国药典》，尝试建立了医用一次性防护服微生物指标薄膜过滤检查的方法，通过采用两种不同材质的产品作为试验样品进行验证，回收率均在50%～200%。通过两种方法进行比较，两种方法合格率均为96.9%，无明显差异，但由于改进的方法为薄膜过滤法，与平皿法比较其每次取样量大，且所用培养基灵敏度更高，故所得菌数精准度较高。