甘薯贮藏特性及活性氧代谢的相关性分析

胡康棣, 赵玉琪, 姚改芳, 周志林, 唐 君, 张 华

(1.合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601; 2.江苏徐淮地区徐州农业科学研究所,江苏 徐州 221131)

甘薯的栽培历史悠久,是世界第七大重要的粮食作物[1],因其高产稳产、适应性强、易于管理、营养丰富而在全球推广。目前国内的甘薯栽培品种繁多,各地区气候及栽培方法差异较大,在块根大小、形状、薯皮颜色等方面均有差异[2]。甘薯贮藏是甘薯生产销售过程中的一个重要环节,贮藏根是甘薯生产中最重要的经济农艺性状,主要用于自身营养储存和繁殖[3],也是人们食用的主要部位[4]。甘薯贮藏根中的水分和碳水化合物含量很高,表皮较薄,收获后有很强的呼吸代谢,由此产生的热量会加速块根的质地软化和腐烂进程。因此,收获后贮藏条件不合适,会导致甘薯很容易腐烂变质[5]。文献[6]在美国调查甘薯运输、贮藏、加工等一系列销售环节时发现,在各个环节中因贮藏不当造成的损失约为总量的25%,其中在批发和销售过程中损失约占总量的19%;在我国,甘薯在贮藏过程中因腐败变质造成的损失约为总量的30%[7]。

影响甘薯贮藏的因素很多,除温度、湿度、空气、微生物病害、机械损伤等外部条件外,甘薯内部过多的活性氧(ROS)也会通过氧化应激对其造成膜脂过氧化、酶活性丧失、核酸结构破坏等[8-10]。研究表明,在果蔬采后贮藏过程中,活性氧积累是导致果蔬采后衰老的重要因素。龙眼果实在贮藏期间出现活性氧积累、膜结构破坏等现象[11];活性氧积累是导致荔枝质膜受损及代谢失衡的重要原因[12]。此外,采后枇杷ROS代谢失衡削弱了果皮的保护能力,导致果实内外环境的恶化,与枇杷采后衰老变质有关[13]。脂氧合酶(LOX)也会对甘薯脂质过氧化产生影响[14],膜脂过氧化的最终分解产物是丙二醛(MDA)[15],因此LOX活性水平和MDA含量是反映植物氧化程度的重要指标[16]。膜脂过氧化会导致甘薯产生不良风味和颜色,导致甘薯质量和营养价值的下降,贮藏时间缩短等问题[17]。植物的抗氧化酶系统是其自身在长期进化过程中形成的对外界不良环境胁迫和衰老所产生的自我保护系统,能够转移、消除活性氧及氧化中间产物,在果实采后衰老进程中起着十分重要的作用[18]。

甘薯对于贮藏条件要求比较高,在运输和贮藏过程中损失较大,这严重限制了甘薯产业的发展。本文研究不同品种的甘薯在耐贮性、ROS、抗氧化酶、MDA、LOX等相关指标的差异,为甘薯耐贮藏品种的选育提供理论参考和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

实验甘薯材料为徐55-2(品种1)、徐32(品种2)、Z15-1(品种3)、美99573(品种4)、商薯9号(品种5)、Sinjami(品种6)、徐22-5(品种7)、Z11-1(品种8)、烟25(品种9)、徐薯23(品种10),均由江苏省徐州市国家甘薯改良中心提供。

1.2 实验方法

1.2.1 超氧阴离子产生速率的测定

超氧阴离子(·O2-)产生速率的测定参照文献[19]方法。称取甘薯叶片0.5 g,加入5 mL 200 mmol/L的4 ℃预冷的PBS缓冲液(pH 值为7.0),研磨至匀浆并于4 ℃、10 000g离心30 min,上清液即为待测液。取待测液和1 mmol/L盐酸羟胺各1 mL混匀,30 ℃水浴30 min,再加入各1 mL 17 mmol/L对氨基苯磺酸和7 mmol/L α-萘胺溶液混匀,25 ℃保温20 min,8 000g离心5 min,取上清液于530 nm处测定其吸光度。同时,以NaNO2制备NO2-标准曲线,根据回归方程计算出样品中·O2-的产生速率。

1.2.2 MDA的量测定

参照文献[20]方法,称取1 g甘薯叶片,加入5 mL 100 g/L三氯乙酸溶液,于研钵研磨成匀浆后,于4 ℃、10 000g离心20 min,收集上清液,低温保存备用。取2 mL上清液(对照空白管中以100 g/L三氯乙酸溶液代替),加入2 mL 0.67%硫代巴比妥酸溶液,混合均匀后沸水水浴20 min,取出冷却至室温后10 000g离心20 min,取上清液,分别测定其在450、532、600 nm处的吸光度。根据回归方程计算出反应混合液中MDA的量。

1.2.3 过氧化氢产生速率的测定

参照文献[21]方法,将2 g的甘薯叶片在液氮中研磨并在3 mL预冷(-20 ℃)丙酮中萃取,10 000g离心20 min取上清液,测量其在508 nm处的吸光度。

1.2.4 抗氧化相关酶活性的测定

粗酶液的制备。将2 g的甘薯叶片在3 mL 4 ℃预冷的50 mmol/L磷酸钾缓冲液(1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L苯甲烷磺酰氟、5 mmol/L抗坏血酸钠和5%聚乙烯吡咯烷酮,pH值7.5)中匀浆,12 000g、4 ℃下离心30 min后,将上清液分成等份试样,-80 ℃下储存备用。

参照文献[22]方法测定抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性。APX活性测定反应体系为3 mL,含有2.5 mL 50 mmol/L、pH值为7.0的PBS缓冲液(1 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L 抗坏血酸、0.1 mmol/L H2O2),0.5 mL粗酶液,各成分混匀后立即于290 nm处测定其吸光度。以每min内吸光度变化0.01记为1个活性单位(U)。

过氧化物酶(POD)的活性测定参照文献[17]方法。3 mL的反应混合液含有50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值为7.0)、0.2 mmol/L愈创木酚和10 mmol/L H2O2。反应开始前快速加入100 μL的粗酶液启动反应,于470 nm处测定吸光度。以每min内吸光度变化0.01记为1个酶活性单位(U)。

超氧化物歧化酶(SOD)活性测定参照文献 [23]方法,5 mL反应混合液中含有5 mmol/L HEPES(pH值为7.6)、0.1 mmol/L EDTA,50 mmol/L Na2CO3(pH值为10.0)、13 mmol/L蛋氨酸、0.025%Triton X-100、63 μmol NBT、1.3 μmol核黄素和酶提取液,4 000 lx日光光照15 min后测定反应液在560 nm处的吸光值。以每min每g甘薯样品的反应体系对核黄素光化还原的抑制为50%为1个SOD活性单位(U)。

过氧化氢酶(CAT)活性测定按文献[24]方法。反应体系为1 mL,包含150 μL的粗酶液、850 μL的反应液(10 mmol/LH2O2、30 mmol/L磷酸钾缓冲液,pH 值为7.0)。混合后在240 nm处检测吸光度的变化。以每min内吸光度变化0.01记为1个活性单位(U)。

1.2.5 LOX活性的测定

LOX活性测定参照文献[25]方法。称取甘薯样品0.5 g,放入预冷的研钵中加入5 mL预冷的PBS缓冲液(200 mmol/L,pH 值为6.5),在冰上研磨至匀浆,转移至10 mL离心管,4 ℃ 10 000g离心20 min,上清液即为LOX粗酶液。反应体系为PBS缓冲液(200 mmol/L,pH 值为6.5),0.25%吐温20与0.25%亚油酸的混合物,加入适量粗酶液,于234 nm处测定其吸光度,记录3 min内每隔10 s的吸光度。以每min内吸光度变化0.01记为1个活性单位(U)。

1.2.6 数据处理及分析方法

均值及标准偏差计算及作图采用Excel 2010,动态热图、组内相关性分析、主成分分析于https://www.omicshare.com/在线工具进行。

2 结果与分析

2.1 不同品种甘薯的贮藏特性分析

薯块在温度为11～15 ℃、相对湿度为80%～90%的甘薯库中贮藏,贮藏6个月后观察记录薯块的腐烂率,并进行分级。每个甘薯品种贮藏特性实验包括3个生物学重复,每个生物学重复包含15个块根。10个甘薯品种的腐烂率与贮藏特性见表1所列。

表1 10个甘薯品种的贮藏特性分析

2.2 抗氧化酶和LOX的活性分析

为研究活性氧清除能力与甘薯贮藏性能之间的关系,本文测定了不同品种甘薯叶片中抗氧化酶和LOX的活性，结果如图1所示。

由图1可知,耐贮藏甘薯品种(徐55-2、徐32、Z15-1、美99573、商薯9号和Sinjami)的APX活性普遍高于不耐贮藏的甘薯品种(徐22-5、Z11-1、烟25、徐薯23)的APX活性,徐55-2和商薯9号的APX活性基本一致,徐32和美99573的APX活性基本一致,且略低于徐55-2和商薯9号;耐贮藏品种徐32的CAT活性最高,与6种耐贮藏品种的CAT活性相比,不耐贮藏品种的CAT活性普遍偏低;甘薯中POD、SOD活性与APX、CAT活性结果相类似;不耐贮藏品种(徐22-5、Z11-1、烟25、徐薯23)的LOX活性明显高于耐贮藏品种,耐贮藏品种的LOX活性均不到不耐贮藏品种的1/2。

图1 不同甘薯品种中抗氧化酶和LOX的活性分析

总体上,与不耐贮藏品种相比,耐贮藏品种的抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX活性较高,有利于清除活性氧;LOX的活性较低,有利于防止不饱和脂肪酸的氧化,进而避免膜质过氧化[26]。

2.3 ROS代谢物及MDA的量分析

不同甘薯品种的ROS代谢物及MDA量的分析结果如图2所示。

图2 不同甘薯品种的ROS代谢物及 MDA的量分析

由图2a、图2b可知,与不耐贮藏品种相比,耐贮藏品种(徐55-2、徐32、Z15-1、美99573、商薯9号和Sinjami)的H2O2的量和·O2-产生速率更低;由图2c可知,耐贮藏品种的MDA的量普遍低于不耐贮藏品种,但耐贮藏品种Sinjami的MDA的量略高于不耐贮藏品种烟25。总之,与耐贮藏品种相比较,不耐贮藏品种中的H2O2、·O2-和膜质过氧化产物MDA的量较高。

2.4 抗氧化相关指标的相关性分析

为研究甘薯ROS代谢、抗氧化酶与甘薯贮藏特性的关系,本文进行了甘薯生理生化指标间的相关性分析，结果如图3所示。

从图3可以看出，抗氧化酶SOD与CAT、APX活性有着明显的正相关,相关系数分布在0.72～0.89之间;POD与SOD、CAT、APX活性也存在正相关关系,但相关系数较弱,分布在0.33～0.46之间;LOX活性、MDA及H2O2的量、·O2-产生速率之间也存在明显的正相关关系,相关系数分布在0.83～0.98之间;但4种抗氧化酶活性与LOX活性、MDA及H2O2的量、·O2-产生速率之间呈明显负相关,相关系数在-0.47～-0.93之间；贮藏特性与SOD、POD、CAT、APX等抗氧化酶活性呈正相关,而与LOX活性、MDA及H2O2的量、·O2-产生速率呈负相关,表明甘薯贮藏特性和ROS代谢紧密联系。

图3 甘薯贮藏特性、酶活性与ROS 代谢物的相关性分析

2.5 抗氧化相关指标的主成分分析

不同甘薯品种抗氧化相关指标的主成分分析如图4所示。

图4 不同甘薯品种指标的主成分分析

图4中,PC1和PC2分别表示数据的79.3%和10.7%的可变性。从图4可以看出,在PC1中耐贮藏品种徐32、徐55-2和Z15-1之间存在明显的聚类,与耐贮藏品种美99573、商薯9号、Sinjami之间也存在明显的聚类。此外,不耐贮藏品种徐22-5、Z11-1、烟25也存在聚类,这表明耐贮藏品种和不耐贮藏品种在生理指标上有一定的差异。

2.6 抗氧化相关指标的热图分析

为更直观地展示不同甘薯品种生理指标的差异,本文进行了热图分析，结果如图5所示。从图5可以看出,徐32、徐55-2、Z15-1、美99573和Sinjami的抗氧化酶SOD、CAT、APX、POD活性比较高,而LOX活性、MDA及H2O2的量、·O2-产生速率较低;徐22-5、Z11-1、烟25和徐23品种整体情况更为接近,即抗氧化酶活性较低,同时LOX活性、MDA及H2O2的量、·O2-产生速率明显较高。

图5 不同甘薯品种生理生化指标的热图分析

总体上,徐32、徐55-2、Z15-1、美99573、Sinjami品种表现出较高的抗氧化能力和较好的贮藏特性;徐22-5、Z11-1、烟25和徐23品种的抗氧化能力较低,贮藏特性较差。

3 结 论

本研究从甘薯抗氧化系统、腐烂率等方面综合评价了甘薯的耐贮性,发现甘薯的抗氧化能力在不同品种之间有显著差异,抗氧化酶活性高的品种,其清除ROS的能力强,耐贮藏特性更强。耐贮藏品种徐55-2、徐32、Z15-1、美99573、商薯9号、Sinjami与不耐贮藏品种徐22-5、Z11-1、烟25、徐薯23相比,具有较高的APX、POD、CAT、SOD等抗氧化酶活性和较低的LOX活性。同时,耐贮藏品种中表现出较低的ROS代谢物的量,包括H2O2、·O2-和MDA。相关性分析结果表明,抗氧化酶活性与甘薯的耐贮性呈显著正相关,而与ROS代谢物的量和LOX活性呈负相关。主成分分析表明,耐贮藏品种与不耐贮藏品种之间形成不同的聚类。本文为甘薯的采后贮藏保鲜、减少甘薯在贮藏过程中的经济损失及耐贮藏甘薯品种的快速选育提供了理论参考。