高效液相色谱法测定蜜饯中柠檬黄的不确定度评定

◎ 张慧琼，郑陆红，陈嘉敏

（1.广东省食品工业公共实验室，广东 广州 511442；2.广东省食品工业研究所有限公司，广东 广州 511442；3.广东省质量监督食品检验站，广东 广州 511442）

蜜饯，是一种以果蔬等为主要原料，添加（或不添加）食品添加剂和其他辅料，经糖或蜂蜜或食盐腌制（或不腌制）等工艺制成的制品[1]。从国家市场监督管理总局公布的2019—2021年食品监督抽检数据来看，着色剂的不合格批次数和涉及的着色剂种类呈上升趋势[2]。

食用柠檬黄是一种水溶性合成色素，外观呈鲜艳的嫩黄色。适量的柠檬黄可以安全地用于食品、饮料、药品及化妆品的着色，还可用于蚕丝、羊毛的染色等。由于合成色素的确能改善食品的色泽，为刺激消费者的购买欲，制作商将其广泛用于冷冻饮品、糖果包衣、果冻以及蜜饯等的着色。但是合成着色剂存在一定的毒性、致泄性，还会影响儿童的智力发育[3]。其中，柠檬黄可能会对人体引发过敏症状，包括焦虑、哮喘、荨麻疹、视觉模糊偏头痛等。因此，在蜜饯中检测柠檬黄含量非常有必要。食品检验的工作程序复杂，实验过程中难免会受到各种因素的影响，导致检测结果和真实值之间出现一定的误差。为了使分析结果更加客观公正，需要引入测量不确定度。不确定度表明测量结果可能的分散程度，指对测量正确性的可疑程度，是测量结果质量高低的一种定量表达方式[4]。本文根据《食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》（GB 5009.35—2016）[5]，以蜜饯中柠檬黄的检测为例，依据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[6]，探讨食品检测过程中测量不确定度来源、影响因素和测定方法，以期为食品检验中测量不确定度的研究与应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

某品牌蜜饯：市售。

柠檬黄标准品：海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司；柠檬酸：国药集团化学试剂有限公司；聚酰胺（100～200目）：源叶有限公司；甲酸：广州化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯）：上海星可高纯溶剂有限公司；乙酸铵：福晨（天津）有限公司；氨水：广州化学试剂有限公司；无水乙醇：成都市科隆化学品有限公司；实验室用水为Milli-Q Advantage A10制备的一级水，Millipore公司；乙酸：康科德有限公司；0.45 μm水相滤膜：艾杰尔。

1.2 仪器与设备

1260 InfinityⅡ高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器（DAD）：安捷伦科技有限公司；C18色谱柱（250 mm×4. 6mm，5 μm）：飞诺美有限公司；电子天平（十万分之一）：梅特勒-托利多有限公司；超声波清洗机（SB25-12DT）：新芝生物科技股份有限公司；漩涡混合器（IKA MS 3 basic）：德国IKA公司；纯水机（Milli-Q Advantage A10）：默克密理博公司；电热恒温水浴锅（HWS-26）：上海一恒科学仪器有限公司；玻璃砂芯漏斗（G3）：帆船牌；隔膜真空泵：津滕有限公司。

1.3 实验与方法

1.3.1 标准系列溶液的配制

从柠檬黄的标准储备液（1 000 μg·mL-1）中分别吸取0.002 mL、0.010 mL、0.100 mL、0.500 mL和1.000 mL至10 mL容量瓶中，用一级水定容，配制成0.2 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1和100.0 μg·mL-1的标准系列溶液。

1.3.2 试样前处理

根据《食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》（GB 5009.35—2016）[5]，将蜜饯均匀粉碎后，准确称取试样5.00 g，放入100 mL小烧杯中，加水30 mL，温热溶解。样品溶液加柠檬酸溶液（20%）调pH到6，加热至60 ℃，将1 g聚酰胺粉加少许水调成糊状，倒入样品溶液里并搅拌。以G3垂融漏斗抽滤，用60 ℃pH为4的水洗涤5次，接着用甲醇-甲酸混合液（6+4，体积比）洗涤5次，再用水洗至中性；用乙醇-氨水-水混合液（7+2+1，体积比）解吸5次，直至色素完全解吸。收集洗脱液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至5 mL容量瓶，混匀后经0.22 μm微孔滤膜过滤，收集滤液供高效液相色谱仪分析测定。

1.4 色谱条件

色谱柱：phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温：35 ℃，流动相：以甲醇为A相，以0.02 mol·L-1乙酸铵溶液为B相，梯度洗脱，洗脱方式见表1，流速1.0 mL·min-1，进样量10 μL，波长428 nm，二极管阵列检测器检测。

表1 梯度洗脱表

2 结果及分析

2.1 数学模型

式中：X为试样中柠檬黄的含量，g·kg-1；C为进样液中柠檬黄的浓度，μg·mL-1；V为试样定容体积，mL；m为试样质量，g；1 000为换算系数。

2.2 分析不确定度的来源

根据测定方法的主要步骤，高效液相色谱仪检测蜜饯中柠檬黄含量的不确定度主要有以下5类[7]。①标准工作液配制产生的相对标准不确定度。②样品称量产生的相对标准不确定度。③试样定容体积产生的相对标准不确定度。④求样品浓度时用最小二乘法拟合标准曲线产生的相对标准不确定度。⑤样品重复性测定引入的相对标准不确定度。详见图1。

图1 高效液相色谱法测定蜜饯中柠檬黄的不确定度来源图

2.3 标准不确定度分量评定

2.3.1 标准工作液配制产生的相对标准不确定度urel(B)

柠檬黄标准物质是由北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司提供，该标物由证书给出的纯度为1 000 μg·mL-1，相对扩展不确定度为1.0%，正态分布（包含因子k=2），相对标准不确定度为

2.3.2 样品称量产生的相对标准不确定度ucrel(m)

依据方法要求，使用千分之一的天平称量，称取混合均匀的试样5.000 g，根据检定证书，该天平给出的0～50 g（0～5 000 e，e=10 d，d=1 mg)称量范围的允许误差为5 mg，按均匀分布则引入的标准不确定度为相对标准不确定度为

2.3.3 样品定容体积产生的相对标准不确定度ucrel(V)

（1）标定容量瓶带来的不确定度。样品经前处理，最后用5 mL容量瓶定容，根据《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）[8]，A级单标线5 mL容量瓶，其容量允许差为±0.020 mL，按均匀分布引入的标准不确定度为，相对标准不确定度为

（2）由温度效应引入的不确定度。玻璃器皿在20 ℃校准，实验室的温度在（20±5）℃变动。可通过计算该温度范围和体积膨胀系数来评定该影响引起的不确定度。水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1，由温度波动引起的体积偏差为V×10 ℃×2.1×10-4℃-1，按均匀分布，由温度变化带入的相对标准不确定度为

（3）样品定容体积产生的相对标准不确定度ucrel(V)。试样定容体积产生的合成相对标准不确定度为

2.3.4 求样品浓度时用最小二乘法拟合标准曲线产生的相对标准不确定度urel(c)

使用校准曲线计算柠檬黄的浓度，配制5个标准溶液，浓度分别为0.200 0 μg·mL-1、1.000 0 μg·mL-1、10.000 0 μg·mL-1、50.000 0 μg·mL-1和100.000 0 μg·mL-1，平均值每个点各测3次，结果见表2。

表2 柠檬黄标准系列溶液测定结果表

线性最小二乘法拟合曲线的相关系数r2为1.000，以含量为横坐标，峰面积为纵坐标得方程y=bx+a=31.608x+0.378，残余标准偏差为

测 量 提 取 溶 液 两 次 得 浓 度 为36.10 μg·mL-1、36.52 μg·mL-1，即平均值c=36.31 μg·mL-1，求样品浓度时用最小二乘法拟合标准曲线产生的标准不确定度为

式中b为斜率，p为测试的次数，n为测试校准溶液的次数，求样品浓度时用最小二乘法拟合标准曲线产生的相对标准不确定度为

2.3.5 样品重复性测定引入的相对标准不确定度urel(X)

影响测量结果重复性的因素主要有人员操作和读数差异、样品不均匀、测量仪器的变动性等。各种随机因素合并引起的重复性相对标准不确定度，可在重复性测量条件下统计分析一系列测量结果得到。用同一台高效液相色谱仪，在重复性条件下对蜜饯进行了6次独立重复试验，测定结果分别为0.034 g·kg-1、0.036 g·kg-1、0.036 g·kg-1、0.035 g·kg-1、0.033 g·kg-1、0.035 g·kg-1。

以标准偏差表示测量的重复性，按贝塞尔公式计算，则

本实验测量6个样品，平均值为0.035 g·kg-1，当报告平均值时，应用早先预评估的标准偏差，测量的平均值的标准不确定度为

2.3.6 合成相对不确定度、相对扩展不确定度和扩展不确定度的评定

（1）合成相对标准不确定度的评定。综合以上由标物、样品称量、样品前处理过程、求样品浓度时最小二乘法拟合标准曲线和重复性试验5个方面产生的相对标准不确定度，得到的合成相对标准不确定度为

（2）相对扩展不确定度和扩展不确定度的评定。当置信概率为95%时，取包含因子k=2，相对扩展不确定度为Urel=k×ucrel(W)=2×0.015 4=3.08%。样品中柠檬黄检出0.035 g·kg-1，则其扩展不确定度为

2.3.7 测量结果不确定度报告

根据不确定度评估后，柠檬黄测定结果为0.035 g·kg-1；扩展不确定度为U=0.001 g·kg-1（k=2），其结果可表示为X柠=(0.035±0.001) g·kg-1，k=2。

3 结论

本文以柠檬黄为例，分析了高效液相色谱法测定蜜饯中柠檬黄的不确定度评定，本实验中，前处理过程产生的相对标准不确定度最大，即本实验中前处理是影响结果的关键，因此在检验工作的过程中，需要给予重视，确保检验结果的准确可靠。