青天葵提取液清除螺蛳粉中亚硝酸盐的研究

◎ 谢云峰，陈 瑶，陈丽燕，谢集照，邱卓妍，张 伟，郑艳燕

（1.广西医科大学 药学院，广西 南宁 530021；2.广西医科大学 公共卫生学院，广西 南宁 530021；3.广西医科大学 基础医学院，广西 南宁 530021）

亚硝酸盐是一类无机化合物的总称，其具有良好的防腐、呈色保鲜作用。亚硝酸盐也是国家食品卫生标准中严格控制使用量的食品添加剂，常用于腊味、腌菜、凉菜等食品中[1]。但是过量摄入亚硝酸盐会引起机体血液中血红蛋白与氧结合能力降低，导致组织缺氧，同时还会使血管扩张，血压降低[2]，此外，机体胃肠道在消化肉制品的过程中会产生蛋白质分解产物，其含氮产物与亚硝酸盐发生作用转化成的亚硝胺可能致癌[3]。如果人体过量或长期摄入亚硝酸盐对健康极为不利。螺蛳粉是起源于广西柳州的特色小吃，深受广大消费者的喜爱。螺蛳粉汤汁浓郁、酸辣可口，配菜丰富，包括酸笋、酸豆角、萝卜干、腐竹、油豆腐、黑木耳以及油炸花生等。但是，由于其配菜中有腌制酸菜食品，存在亚硝酸盐含量超标[4]的潜在隐患。

青天葵[Nervilia fordii(Hance) Schltr.]为兰科芋兰属植物，盛产于广东、广西，不仅具有清热解毒、清肺止咳的效用，还具有明显的抑菌作用[5]。青天葵的主要有效成分为黄酮类，此外还存在甾醇类、生物碱类和氨基酸类等[6]。黄酮类物质可防治心血管疾病，具有抗肿瘤、抗炎症、抗衰老氧化[7]的作用。据报道，含有黄酮的水果蔬菜能降低或清除亚硝酸盐[8]。黄酮类物质能有效阻断亚硝胺的合成，且亚硝酸盐清除活性与黄酮种类及含量存在相关性[9]。目前，能代替亚硝酸盐的天然无公害类食品添加剂较少，基于此，本文通过检测螺蛳粉中亚硝酸盐的含量，探讨青天葵提取液对螺蛳粉及腌制品中亚硝酸盐的清除作用，以期开发青天葵中有效成分的新用途，进一步保障食品安全。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青天葵，广西一心医药有限公司，由广西壮族自治区食品药品检验所韦家福主任中药师鉴定为青天葵[Nevilia fordii(Hance) Schltr.]的全草，药材标本保存于广西医科大学药物化学实验室。螺蛳粉样本，采用随机抽样法，采样于南宁市内的青秀区、西乡塘区、邕宁区、江南区和兴宁区5个城区的螺蛳粉店，每个城区采5～6份样，共采集31份样品；柴火烟熏腊肉、珍珠腊肠，购于南宁市青秀区超市。

60%乙酸、氯化铵缓冲液、95%乙醇、5 µg·mL-1亚硝酸钠标准溶液、0.4%对氨基苯磺酸溶液、0.2%盐酸萘乙二胺、6 mol·L-1盐酸溶液、硫酸锌溶液、0.5 mol·L-1氢氧化钠溶液、芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号100080-200306）、甲醇、石油醚（60～90 ℃）、AlCl3、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3NaAc、冰醋酸等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JJ1000型电子天平（d=0.01 g、Max=1 000 g、e=10 d），常熟市双杰测试仪器厂；台式离心机，上海棱光技术有限公司；722sp型可见分光光度计，上海棱光仪器公司；美的多功能电磁炉；2608DM型多用电热套，山东省鄄城永兴仪器厂；DZF-300真空干燥箱，武汉亨泰达仪器设备有限公司；HH-S型恒温水浴锅；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；SHB-III循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 青天葵提取液的制备

按物料比1∶15称取青天葵，用15倍量的95%乙醇在85 ℃水浴回流提取2次，每次提取1 h，过滤，脱色，合并滤液。滤液减压回收溶剂至无醇味，浓缩得膏状物，临用时用蒸馏水配制成所需浓度。

1.3.2 螺蛳粉样品处理

用搅拌机将整碗螺蛳粉、米粉、配菜样品分别搅拌打碎，分别取10 g已粉碎的整碗螺蛳粉、米粉、配菜样品于烧杯中（汤汁样品取10 mL），加70 mL水和12 mL氢氧化钠溶液（20 g·L-1），混匀，过滤，用氢氧化钠溶液（20 g·L-1）调样品pH至8，定量转移至200 mL容量瓶中，加10 mL硫酸锌溶液，混匀。如不产生白色沉淀，可再补加2～5 mL氢氧化钠溶液，搅拌混匀。置于60 ℃水浴中加热10 min，取出后冷至室温，加水至刻度，混匀。放置0.5 h，用滤纸过滤，弃去初滤液20 mL，收集滤液备用。

1.3.3 亚硝酸钠标准曲线的绘制方法

准确吸取0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL和5.0 mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0.0 μg、2.5 μg、5.0 μg、10.0 μg、15.0 μg、20.0 μg和25.0 μg的亚硝酸钠），置于25 mL容量瓶中，加入氯化铵缓冲溶液4.5 mL，60%乙酸2.5 mL，2 g·L-1盐酸奈乙二胺显色剂5 mL，混合摇匀，定容，避光静置25 min，于波长540 nm处测定吸光度。直线回归方程为y=0.009 9x+0.000 7，R2=0.997 7，在2.5～25.0 μg·mL-1范 围 内NaNO2的吸光度与其含量呈现出良好的线性关系。

1.3.4 芦丁标准曲线绘制

采用AlCl3-HAc-NaAc显色法[10]，配制系列质量浓度芦丁对照品溶液（c=0.15 g·L-1）。精密量取适量标准溶液，置于25 mL容量瓶中，加入0.1 mol·L-1AlCl3溶液1.5 mL，HAc-NaAc缓冲溶液（pH 5.5）1 mL，加70%乙醇稀释定容，摇匀。以相应试剂为空白，在405 nm波长处测定其吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，对照品质量浓度（c）为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为A=0.025 17c+0.005（r=0.998 2），芦丁在7.35～29.60 mg·L-1呈线性关系。

1.3.5 对照品溶液的制备

称取芦丁对照品30.0 mg，用甲醇溶解后定容至20 mL容量瓶中，制得1.50 mg·mL-1对照品芦丁贮备液。准确吸取对照品贮备液5 mL，加甲醇稀释定容至50 mL，制备质量浓度为0.15 g·L-1的对照品溶液。

1.3.6 供试品溶液的制备

取经60 ℃干燥4 h后的青天葵，粉碎，过筛，精密称取1 g，加入石油醚（60～90 ℃）50 mL，600 W超声30 min，过滤，重复2次，挥干，加入70%乙醇100 mL，称重，超声30 min，静置，过滤，得10 mg·mL-1样品溶液。

1.3.7 青天葵药材总黄酮含量测定

精密称取青天葵1 g，按1.3.6的方法制备供试液，按1.3.4项操作测定吸光度，平行测量3次，计算样品总黄酮含量为2.13%。

1.3.8 亚硝酸盐清除率的测定

亚硝酸盐含量检测按国标GB 5009.33—2016盐酸萘乙二胺法测定[11]。精密量取1 mL亚硝酸盐应用液，分别置于25 mL比色管中，一支用作空白对照，另一支加入一定量青天葵提取液，摇匀，反应一定时间。两份各加入1 mL的0.4%对氨基苯磺酸溶液，摇匀静置4 min之后，再加入0.5 mL的0.2%盐酸萘乙二胺，加入氯化铵缓冲液1 mL，加水定容至刻度线处；静置15 min之后，用1 cm比色皿，空白管调零，测定波长在540 nm处的测吸光度，分别标记A1（添加青天葵提取液的吸光度）、A2（未添加青天葵提取液的吸光度）。

按照公式（1）计算青天葵提取液对亚硝酸盐的清除率[12]。

1.3.9 对肉制品中亚硝酸盐清除率的测定

取3份1 mL的肉制品的上清液在温度为90 ℃的条件下水浴3 min，一份用作空白管；另两份加入4 mL的青天葵提取液，调节pH为9，反应15 min，按照体外测定亚硝酸盐含量的方法，测定其清除率。

1.3.10 对螺蛳粉中亚硝酸盐清除率的测定

分别平行取3份按1.3.2方法处理的螺蛳粉汤汁、粉、配菜及整碗螺蛳粉样品的上清液各1 mL在温度为90 ℃的条件下水浴3 min，1份做样品对照管；另2份分别加入4 mL的青天葵提取液，并且调节pH为9，反应15 min后测定清除率。

1.4 青天葵提取液清除亚硝酸盐的反应条件的优化试验

1.4.1 单因素试验

本试验设青天葵提取液与亚硝酸盐反应温度、反应pH以及青天葵提取液用量3个单因素试验，并采用正交试验确定青天葵提取液清除亚硝酸盐的最佳反应条件。

1.4.2 正交试验

根据单因素试验结果，选择反应温度、反应pH、青天葵用量3个因素，选择不同水平进行L9(34)正交试验，因素水平设计见表1。

表1 正交试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 影响青天葵提取液清除亚硝酸盐的主要因素

2.1.1 反应温度对亚硝酸盐清除率的影响

取5份5 mL青天葵提取液，将pH调至8，于70 ℃水浴保温3 min后各加入1 mL标准亚硝酸盐溶液。分别于50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃水浴保温，15 min后测定清除率。试验重复3次，结果如图1所示，反应温度介于50～80 ℃时，温度越高，青天葵对亚硝酸盐的清除率越高，当反应温度为80 ℃时清除率为25.89%。温度高于80 ℃青天葵对亚硝酸盐的清除率反而降低。其原因可能与温度升高青天葵提取液中活性成分如多酚类黄酮类化合物分解有关[12]。

图1 反应温度对亚硝酸盐的清除率的影响图

2.1.2 反应pH对亚硝酸盐清除率的影响

取5份5 mL青天葵提取液，于70 ℃水浴保温3 min，各加入1 mL标准亚硝酸钠溶液并将pH分别调至5、6、7、8和9，15 min后测定清除率。试验重复3次，结果如图2所示，pH在5～8，反应的pH越高，青天葵对亚硝酸盐的清除率越高，当反应pH为8时清除率最大，为34.31%。

图2 反应pH对亚硝酸盐的清除率的影响图

2.1.3 青天葵提取液用量对亚硝酸盐清除率的影响

取5份1 mL标准亚硝酸盐溶液，于70 ℃水浴保温3 min后各加入1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL的青天葵提取液，并将pH调至8，15 min后测定清除率。试验重复3次，结果如图3所示，青天葵对亚硝酸盐的清除率在一定范围内呈量效关系，青天葵提取液用量为3 mL时清除率最大为37.62%。

2.2 青天葵对亚硝酸盐清除率的正交试验结果

青天葵对亚硝酸盐的清除率的最佳反应条件的正交试验结果及方差分析见表2和表3。由正交试验结果可知，试验结果的影响因素大小为反应温度＞反应pH＞青天葵提取液用量。结合正交试验K值分析与方差分析结果，其最优反应条件为A2B2C1，而根据清除率得出的最佳反应条件为A3B3C3。即反应液温度90 ℃、反应液pH为9、青天葵提取液用量5 mL。将两组反应条件A2B2C1与A3B3C3进行对照实验，测定清除率，其结果如表4。由表4可知，最佳反应条件为A2B2C1，即反应温度为80 ℃，反应pH为8，青天葵提取用量为3 mL。

图3 青天葵提取液用量对亚硝酸盐的清除率的影响图

表2 正交试验结果表

表3 方差分析表

表4 两种最佳反应条件的清除率比较表

2.3 青天葵在最佳条件清除亚硝酸盐的试验结果

如表5所示，在最佳反应条件下，青天葵提取液对整碗粉及腌制品腊肠和腊肉的亚硝酸盐的清除率分别为39.27%及30.31%和35.25%，提示青天葵提取液对螺蛳粉及腌制品腊肠和腊肉的亚硝酸盐清除效果较好。

表5 最优条件下青天葵提取液清除亚硝酸盐的效果表

3 结论

广西壮族自治区地方标准《食品安全地方标准 柳州螺蛳粉》（DBS 45/034—2016）[13]规定其螺蛳粉亚硝酸盐的含量＜20 mg·kg-1，但研究显示，过多地食用螺蛳粉存在亚硝酸盐超标的隐患。本研究结果表明青天葵提取液对螺蛳粉中亚硝酸盐具有一定的清除作用，其原因可能与青天葵中含有的黄酮类有关。目前，由于尚未发现清除亚硝酸盐的专属性酶类化合物，从丰富的中药资源中探索开发外源性的亚硝酸盐清除剂非常有必要[14]。本研究所选用的青天葵提取液的制备方法简单，可应用于食品加工过程中，从而有效降低人们在日常饮食中对亚硝酸盐的摄入量。