肠道微生物与NLR蛋白的相互关系①

顾亚琴 陈 磊 吴红雁 （江苏医药职业学院，盐城 210042）

1 肠道微生物群

微生物几乎覆盖所有宿主的黏膜表面，定植在不同的身体壁龛，包括胃肠道、皮肤、口腔、泌尿生殖道和呼吸道，这些微生物统称为微生物群落，主要由细菌、真菌、病毒、原生动物和古菌组成，是复杂、广泛、动态的［1-2］。肠道是人体最大的消化和排泄器官，在肠道中寄生着约数百亿种微生物，是人体最大的微生物室［3-4］。

目前，微生物分析主要依赖于无创且容易获得的粪便样品，但粪便剖面不能代表宿主体内发生的完整情况，也不能解释肠道微生物区系的空间异质性。在肠道系统中，细菌种类和群落在整个管腔内分布不均，细菌的密度和多样性沿肠道纵轴增加［5-6］。通常，小肠中以快速生长的兼性厌氧菌为主，而盲肠和结肠则更利于糖溶厌氧菌生长。同时，黏液层也为宿主体内很大一部分细菌提供了栖息地［7］。越来越多的证据表明，高度多样化的微生物有助于维持黏膜屏障健康，反之亦然［8-9］。黏膜相关微生物群与宿主天然免疫系统间的相互作用值得关注，可以作为粪便群落研究的补充。

2 核苷酸结合寡聚化结构域样受体

宿主免疫系统与肠道微生物间的通讯通过表达于免疫细胞上或免疫细胞内的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）的作用进行。核苷酸结合寡聚化结构域样受体（nucleotide-binding and leucine-rich repeat-containing receptors，NLRs）是一类细胞质内PRRs，可通过调控一系列信号级联反应参与机体的获得性免疫和固有免疫应答过程，可与病原相关分子模式和损伤相关分子模式直接结合，启动天然免疫应答［10-11］。在共生微生物和宿主免疫系统间的通讯中，NLR 蛋白是PRRs 的重要成员之一。

NLRs是一种高度保守的细胞内蛋白质，在人类基因组中有20 多个已鉴定的NLRs 家族成员，这些蛋白均由中央核苷酸结合寡聚化结构域、C 末端亮氨酸富集结构域和N 末端效应结构域构成。根据N末端结构域的不同，目前一般将NLRs 分为5 个亚族［12］：①含酸性反式激活结构域的NLRA：NLRA 亚族只有1 个成员，即Ⅱ类主要组织相容性复合物反式激活因子（class Ⅱmajor histocompatibility com‐plex transactivator，CⅡTA），负责将蛋白质转运至细胞核，是MHC Ⅱ类分子（major histocompatibility complex class Ⅱmolecule）转录的正向调节剂；②含杆状病毒抑制剂重复结构域的NLRB：NAIP是NLRB亚族的唯一成员，是一种抗凋亡蛋白；③含半胱天冬氨酸蛋白酶募集结构域的NLRC：由NOD1、NOD2、NLRC4 3 个成员组成，是微生物入侵及免疫系统的监测器，主要通过激活或抑制信号通路影响细胞因子分泌；④含pyrin（pyrin domain，PYD）结构域的NLRP：由NLRP1、NLRP3、NLRP6 等14 个成员组成，介导凋亡和炎症信号传导；⑤NLRX 亚族成员NLRC3、NLRC5 和NLRX1 的N 末端包含1 个未知结构域，参与自噬的起始，并调节炎症反应和Ⅰ型IFN信号通路传导。

与其他PRRs 相同，NLR 家族的功能是感知病原体或损伤相关的分子模式，其在PRR 中具有独特的配体多样性和下游效应功能。一些NLRs，如NLRP1、NLRP3、NLRC4，NAIP 等作为炎症小体传感器，可通过与其配体结合，诱导IL-1 和IL-18 的分泌及炎症形式的细胞焦亡参与机体免疫调节过程［12］。NLR 蛋白的另一个主要功能是调节炎症信号通路，包括NF-κB 和MAPK。虽然一些NLR 家族成员，如NOD1 和NOD2，可引起这些通路对刺激的激活，但还有一些NLR 蛋白，如NLRX1、NLRC3 和NLRP12则是作为炎症通路的负调节因子，这些共同构成了NLR 生物学的复杂性［13-14］。此外，已有研究表明NLR 蛋白与肠道微生物群间的干扰，以及这些复杂的相互作用对肠道稳态和炎症产生的巨大影响。

3 NLRs与肠道微生物群间的相互作用

3.1 NOD1/2（NLRC1/2） NOD1 和NOD2 同属NOD 样蛋白，具有同源性且信号通路高度相似，NOD1/2 广泛表达于多种细胞类型，如上皮细胞、基质细胞和内皮细胞。作为众所周知的PRRs，其可识别具有较高特异性的胞浆细菌肽聚糖片段，目前研究者认为这些肽聚糖分子主要由以下几种方式进入宿主细胞［15-18］：①胞内病原菌感染，如弗氏志贺菌感染，这种胞内病原菌可激活NOD 蛋白信号通路［15］；②胞外菌通过分泌系统将细菌肽聚糖传递到宿主细胞。研究显示，幽门螺杆菌的分泌系统及革兰氏阴性菌外膜囊泡可将细菌肽聚糖传递到宿主细胞［15-18］；③在上皮细胞中，细菌肽聚糖可通过内吞作用进入宿主细胞；④寡肽转运子（如PEPT1、SLC15A4）可有效携带肽聚糖片段进入宿主细胞质；⑤感染细胞周围的正常细胞内NOD1信号通路可被间隙连接介导活化。此外，在小肠远端，纳米颗粒能够诱捕环境中的肽聚糖或口服来源的蛋白抗原，利用上皮M 细胞进入派尔氏集合淋巴小结，将肽聚糖转运到肠道组织中的免疫细胞，进而维持肠道免疫稳态［19］。这些进入胞质的途径表明NOD1 和NOD2 蛋白可能感应胞外细菌释放的配体，包括肠道共生菌的成分。与配体结合后，NF-κB-ERKMAPK 信号被激活，进而促进各种促炎细胞因子和趋化因子表达，以及抗菌肽（antimicrobial peptide，AMPs）和活性氧产生。由于NOD1/2 有助于胞浆监测，这些蛋白质作为宿主-微生物相互作用的重要调节因子，也可控制肠道异常炎症的易感性。

早期研究显示NOD1 在多种细菌感染中具有抗菌作用，但NOD1 对整个肠道微生物群落的影响不太明显［20-22］。BOUSKRA 等［23］和GUTIERREZ 等［24］用16S核糖体RNA（rRNA）的定量PCR对NOD1缺乏小鼠的整个细菌王国进行了分析，结果表明，与WT 小鼠相比，总细菌增加了约100 倍。此外，在NOD1 缺乏的小鼠中存在不同数量的细菌，包括梭菌、拟杆菌和肠杆菌科。但这些早期实验使用的是非同窝对照，仍需更多实验进一步验证这一结论。近年YU 等［25］研究发现，C57BL/6 小鼠与NOD1 缺乏小鼠杂交产生的WT 小鼠（WT2）在氧化偶氮甲烷（azoxy‐methane，AOM）-右旋糖酐硫酸钠（dextran sodium sulfate，DSS）-结肠炎相关结肠癌（colitis-associated colon cancer，CAC）模型中的结肠肿瘤明显多于从杰克逊实验室购买的“纯”WT 小鼠（WT1）。虽然WT1和WT2 集落均来源于同一供应商的C57BL/6 小鼠，并被安置在同一小鼠室中，但其具有不同的微生物群组成。这种微生物群的差异与粪便材料移植、队列和交叉构建实验证实的不同肿瘤敏感性直接相关。这项研究不仅强调肠道微生物群通常可由母体传播决定，还间接表明NOD1 缺乏的小鼠可能携带一个生物失调的微生物群，其有助于增加肿瘤易感性。

PETNICKI-OCWIEJA 等［26］发现，NOD2 缺乏的小鼠的回肠和粪便中携带的细菌数量比同窝对照组多，细菌和硬壁菌丰度增加。由于隐窝功能受损，NOD2 缺乏小鼠在回肠末端也表现出抗菌活性降低和机会性病原体对定植的敏感性增加。REHMAN 等［27］使用16SrRNA 基因克隆文库测序和高通量焦测序法将NOD2对肠道微生物群的影响进行了更直接的研究，并证实NOD2 缺乏的小鼠在粪便和末端回肠样本中的细菌负荷高于WT 对照物。另一项研究表明，NOD2 缺乏可导致普通拟杆菌扩张，其通过影响表达IFN-γ 的上皮内淋巴细胞介导小肠异常和炎症［28］。

NOD2 及其与肠道微生物的相互作用与炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）有关，包括克罗恩病（Crohn's disease，CD）和溃疡性结肠炎（ulcer‐ative colitis，UC）。肠道菌群可通过细菌外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMV）的分泌传递免疫调节分子，在结肠炎过程中激活非经典的自噬途径发挥保护作用。但一些易感基因的变异会阻断这一保护作用，导致IBD 发生。CHU 等［29］研究显示OMV的作用机制与IBD 相关基因（ATG16L1 和NOD2）密切相关。在CD 的发展过程中，NOD2 突变是已知最强的遗传危险因素之一。据报道，NOD2 基因（SNP8、SNP12 和SNP13）的3 个主要单核苷酸多态性与CD 有关，并导致胞壁酰二肽的功能表型丧失［30］。REHMAN 等［27］通过CD 患者的回肠活检和粪便研究发现，无论是否有NOD2SNP13 突变，携带NOD2 变异体的患者体内拟杆菌门和厚壁菌门比例均增加。KNIGHTS 等［31］对从CD、UC 和对照患者中收集的178 个肠道样本进行了基因分型，以确定NOD2的危险等位基因，并表明NOD2复合基因型与微生物组成的变化显著相关，特别是盲杆菌和大肠杆菌。

3.2 NLRP3 NLRP3 可对各种微生物（包括共生微生物）、微生物产物和代谢物做出反应［32］。然而在针对基因敲除或突变的NLRP3 小鼠进行的肠道炎症模型实验中，不同实验室得出了相互矛盾的结果。一些研究认为NLRP3 通过限制致病菌维持肠道稳态的保护作用；但另一些研究认为，由微生物激活的NLRP3 有助于疾病的发生发展［33-34］。ZAKI等［35］报道了DSS-和2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）-结肠炎模型中NLRP3−/−小鼠炎症表型恶化，他们将NLRP3 的保护作用归因于非造血细胞产生IL-18，从而促进肠道微生物与宿主免疫细胞间上皮屏障的完整性。事实上，NLRP3−/−小鼠经历了菌血症，抗生素的使用能够改善其恶化的结肠炎表型，这一过程直接涉及了微生物。ALLEN等［36］发现与WT小鼠相比，在NLRP3、Asc 或Casp1 缺乏的小鼠中，AOM-DSS 诱导的肿瘤模型炎症表型增加，肿瘤负荷增加。骨髓嵌合体实验证实了NLRP3 介导的保护依赖于NLRP3 炎症组分在造血细胞中的表达。虽然结论不同，但这两项研究都表明NLRP3 与共生微生物间的相互作用对肠道稳态和抵御炎症至关重要。

HIROTA等［37］直接探究了NLRP3对共生微生物群落的影响，并观察到NLRP3−/−小鼠结肠炎表型恶化，IL-1β、IL-10 和TGF-β 表达减少，并将表型与巨噬细胞和中性粒细胞对微生物产物的反应受损联系起来。该研究还发现，与来自同窝的WT 对照相比，NLRP3−/−小鼠产生了一个独特的微生物群，抗菌分泌物减少且结肠β-防御素表达发生改变。通过末端限制片段长度多态性分析，HIROTA 等［37］发现了几种在WT 或NLRP3−/−小鼠中更丰富的细菌种类，包括肠杆菌科、分枝杆菌和梭菌属成员。该研究首次表征了NLRP3对肠道微生物组成的影响。

与以上研究相反，BAUER 等［38］认为NLRP3 在结肠炎中发挥促炎和致病作用。该研究表明，NLRP3−/−动物结肠炎表型改善，体重减轻，组织学评分较低，并提示了巨噬细胞产生的IL-1β 在疾病发病机制中发挥作用。该团队发表的后续研究直接检测了肠道微生物群对NLRP3 缺乏小鼠DSS-结肠炎严重程度的影响［39］。他们将保护作用与黏膜固有层中CD103+DCs 的增加联系起来，这一发现在MAK'ANYENGO 等［40］的报道中得到扩展：NLRP3−通过IL-1β 抑制CD103+DCs。而后的一项研究则报道了NLRP3 及其与肠道微生物群在肠道炎症背景下相互作用的有害性［41］。这些研究共同表明NLRP3在肠道炎症过程中发挥有害作用。

总之，这些研究探讨了在肠道稳态和炎症背景下NLRP3-微生物相互作用的影响，并提供了共生菌群与炎症途径间一个不太确定的联系。证据显示NLRP3在常驻免疫细胞和非造血细胞中可通过IL-18促进屏障完整性，并通过分泌IL-1β 和AMPs 维持共生细菌的“健康”平衡［40，42］。同时，研究还认为某些共生体可为循环免疫细胞中主要NLRP3 炎症小体的激活提供第一信号，以促进有害的炎症反应。其中一些相互矛盾的发现可能取决于环境因素：如先前存在的微生物区系负荷和组成、住房环境、使用的对照小鼠（是否在同一设施中饲养等）、动物饲料及疾病诱导过程等细节［37-40，42］。

3.3 NLRP6 研究表明，肠道NLRP6 优先在肠细胞和杯状细胞中表达，并在调节肠道稳态、抵御感染、自身免疫反应和肿瘤发生方面发挥重要作用［43］。2011 年，ELINAV 等［44］首次报道了NLRP6-ASC 炎症体信号对肠道微生物群的塑造作用，其可调节宿主对化学剂诱导的结肠炎免疫反应。该课题组还研究了NLRP6-微生物群落相互作用在AOM-DSS-CRC模型发病机制中的影响，并在NLRP6和Asc 缺乏的小鼠中观察到肿瘤发生增强，并可传播到同窝饲养的WT 小鼠中［45］。肠道病原体在胃肠道生理中可触发多种损伤，包括运动减少和内在肠相关神经元丢失。近期有研究揭示了神经元特异性NLRP6 是感染引起的固有肠相关神经元死亡的主要效应器，其可通过控制肠道微生物来逆转［46］。该研究为NLRP6 与肠道微生物群间相关性的研究提供了另一条线索。

为进一步了解炎症体如何参与维持健康的宿主-微生物稳态，LEVY等［47］对与WT或Asc缺乏小鼠同窝饲养的无菌小鼠粪便样本进行代谢组学分析。结果发现代谢产物牛磺酸、组胺和精胺可通过诱导上皮IL-18分泌和下游AMP产生参与NLRP6炎症小体的调节，并推测这些微生物代谢物调节了微生物群落、宿主生理和疾病易感性。近期有研究发现，黄酮类代谢物芹菜素也可通过NLRP6 依赖的信号通路保护DSS诱导的结肠炎［48］。由于DSS诱导的结肠炎模型更适合研究上皮损伤和修复过程中的宿主反应，而不适合研究整个发病机制，HARA等［49］利用IL-10缺陷小鼠增加致病性Th1反应，并使其发展为慢性小肠结肠炎模型，以研究NLRP6-微生物相互作用在自发性结肠炎中的影响。该研究证明，IL-10/NLRP6 双基因敲除小鼠更容易发生自发性结肠炎，并存在一个改变的微生物区系，且阿克曼氏菌丰度增加；还强调了NLRP6 如何通过限制特定共生菌的定植来维持肠道稳态新机制。

然而，并不是所有群体都将NLRP6 作为塑造肠道微生物群和调节肠道炎症的标志性宿主因素。2017 年有研究表明，与同窝对照组相比，NLRP6 的遗传背景对肠道微生物组成无直接影响，NLRP6 缺乏不能提高小鼠对DSS 诱导的结肠炎易感性［50-51］。GÁLVEZ ERIC 等［52］在粪便物质转移实验中进一步支持了NLRP6 对肠道微生物群的调节功能。而TOUBAI等［53］则发现骨髓移植后NLRP6在胃肠道移植物抗宿主病中的致病作用不受微生物群影响。WLODARSKA 等［54］研究表明，NLRP6 缺乏可导致杯状细胞自噬消失，并可通过减少黏蛋白颗粒胞吐影响黏液层形成而直接影响其功能。由于黏蛋白产生受损，NLRP6 缺乏的小鼠更易受肠道病原体感染，且不能维持微生物稳态。该结果显示NLRP6 炎症小体缺乏会导致肠道微生物群落组成和生物位置分布变化。更重要的是，这一发现与VOLK 等［55］使用同窝控制的NLRP6 缺乏小鼠进行的另一项研究结果不同。通过一系列体内外分析，VOLK 等［55］认为，NLRP6 缺乏小鼠形成的黏液层在功能上与WT小鼠难以区分。

针对这些不可忽视的矛盾，持相反观点的研究者就如何尽量减少实验差异，更好地研究肠道微生物群与宿主免疫系统间的因果作用发表了意见。即未来的微生物群研究应包括多种互补的实验模式，不应仅依赖于某一种方法，因为相对于无菌定植小鼠，不同的表型可能发生在同窝控制小鼠的研究中，原因如下：首先，粪便转移过程中大量细菌内流不是一个生理过程，且可能导致定植抗性或炎症反应；第二，不同器官内细菌种类和群落分布不均，粪便中的微生物与盲肠或结肠中的微生物区系不同，可能不代表特定胃肠道区域的真实微生物群落，此外，许多厌氧菌可能在粪便收集或处理时间内已经死亡，在这种情况下，虽然粪便微生物转移或无菌小鼠再克隆是微生物研究的有效方法，但应共同使用同窝育种策略来分析宿主的遗传学影响［42］。

3.4 NLRC4 激活NLRC4 炎症体可产生IL-1β 和IL-18，并可诱导caspase 介导的细胞死亡。有趣的是，虽然ASC 会增强NLRC4 诱导的caspase-1 活化，但NLRC4 炎症体的激活不需要ASC［56-58］。ROM‐BERG等［59］指出NLRC4的功能增强型突变与人类肠道和全身自身炎症性疾病有关。NLRC4 的杂合性功能增强型突变是导致婴儿小肠结肠炎的重要原因之一，是一种以婴儿腹泻和与皮肤、中枢神经系统、肝脏巨噬细胞活化相关的全身表现为特征的慢性炎症性疾病。此外，其他NLRC4突变也被认为与表型类似于NLRP3 的相关自身炎症性疾病综合症相关。但肠道微生物群在人NLRC4 炎症疾病中的潜在作用还未见报道。

小鼠模型的研究揭示了NLRC4 在肠道炎症和炎症诱导的肿瘤发生中的保护作用。CARVALHO等［60］发现与同窝对照的WT 小鼠相比，NLRC4 缺乏小鼠会出现更严重的DSS 诱导的结肠炎，且NLRC4缺乏小鼠更易受肠道沙门氏菌感染，并认为这些小鼠的死亡率增加与IL-1β 减少有关。另一项研究表明，NLRC4 在AOM-DSS-CRC 模型中具有类似的保护作用［61］。该研究发现，与年龄和性别匹配的WT小鼠相比，NLRC4 缺陷小鼠的肿瘤数量和肿瘤负荷显著增加。但ALLEN 等［36］的研究却发现与类似治疗的WT动物相比，NLRC4−/−小鼠的疾病进展或结果无明显差异。这一矛盾可能是由不同结构微生物组成的差异导致。笔者认为有必要进行进一步的严格批判性实验来研究NLRC4 在调节肠道微生物群组成及其对肠道疾病的潜在影响。

4 展望

宿主免疫与肠道微生物间的相互作用及其在肠道稳态和炎症背景下的潜在应用是一个值得研究的领域。然而，不同实验室间相互矛盾的结论以及研究者对单个实验结果重现性的关注均表明微生物领域研究的挑战性日益增强。既往的许多研究没能充分认识到非遗传因素的影响（如住房条件、饮食、小鼠设施、疾病模型和测序方法），这些因素已被证实对微生物群组成具有重要影响，且可能导致不一致的结果。寄主-微生物的相互作用仍是一个年轻且日益精进的领域供科学家探索。有了这些新的共识，在研究宿主对微生物群落结构影响的同时，进行标准化的同窝控制实验设计（包括无菌小鼠和粪便微生物群移植）以尽量减少非遗传因素造成的混杂效应对研究成果至关重要［42］。