四川地区结核分枝杆菌katG、inhA和rpoB基因突变位点耐药水平及突变频率特征分析

陈蕾

结核病是威胁人类健康的重要公共卫生问题之一，随着耐多药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)患者的日益增多，结核病防控工作面临前所未有的挑战。2020年，世界卫生组织(WHO)报道全球MDR-TB或利福平耐药结核病(RR-TB)的治疗成功率为57%，我国仅为54%[1]。对此类肺结核的早期、快速诊断有利于临床采取有效、合理的治疗方案，而可靠的分子或表型药敏方法是确诊MDR-TB或 RR-TB以及选择药物的重要工具[2]。近年来国内外报道基因芯片技术对MDR-TB的诊断具有快速、灵敏、高通量等许多优点[3]，不同抗结核药物的耐药相关基因在耐药突变株中发生的频率差异较大，且引起的耐药水平也存在差异性[4-5]。因此，本文采用基因芯片法(芯片法)通过katG、inhA和rpoB基因突变位点检测耐药基因，微孔板比例法(比例法)通过培养+药物敏感性试验检测表型耐药水平，分析基因突变位点与耐药水平关系及突变频率分布特点，为本地区临床治疗方案选择提供指导。

资料与方法

一、标本来源

收集2020年1月至2021年1月成都市公共卫生临床医疗中心住院肺结核患者痰标本，选取经液体培养阳性且菌种鉴定为人型结核分枝杆菌(Mtb)的分离株，进行比例法检测H或R耐药性为表型耐药，同时完成芯片法检测H或R耐药基因为突变型，共计获得118例Mtb菌株(患者118例)。

二、仪器和试剂

仪器：结核分枝杆菌耐药DNA芯片检测试剂盒、PCR扩增仪、芯片杂交仪、微阵列芯片扫描读片仪均由北京博奥生物技术有限公司提供；BACTECTMMGIT 960全自动分枝杆菌检测/药敏系统购自美国BD公司。

试剂：试验所用分枝杆菌液体MGIT培养基由美国BD公司提供。

三、检测方法

1 标本采集 按照结核病实验室标准化操作流程[6]收集合格的痰标本，标本量3～5mL，对不合格的标本重新留取。对同一份痰标本进行比例法检测耐药表型、芯片法检测耐药基因。

2 微孔板比例法检测H和R耐药表型

采用BACTEC MGIT 960培养基，按照《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》[7]的要求进行培养，培养产物均使用硝基苯甲酸(PNB)/噻吩-2-羧酸肼(TCH)指示剂初步鉴定为Mtb和非结核分枝杆菌。将分离的Mtb菌株，采用微孔板比例法，按照《结核病实验室检验规程》[8]的要求进行药敏试验。判断耐药标准：含药培养基上菌落数/对照培养基上菌落数≥1%为生长。对照管生长，含药浓度管不生长为敏感，含药浓度管生长为耐药。2种含药液体培养基的药物高低浓度分别为H0.80 μg/mL、0.40 μg/mL,R 8.00 μg/mL 、4.00 μg/mL。

3 基因芯片法检测katG、inhA和rpoB基因突变位点

取1 mL标本按基因芯片仪器使用操作说明测试。通过检测位点的突变情况判断耐药性，如R耐药相关基因ropB基因511(T→C)、513(C→A)、516(G→T,A→T,A→G)、526(C→T,C→G,A→T,A→G)、531(C→T,C→G)、533(T→C)位点及H耐药相关基因katG基因的315(G→C,G→A)位点和inhA基因的-15(G→T)位点。如果耐药相关基因为野生型，判断为相应药物敏感，如耐药相关基因为突变型，判断为相应药物耐药。

四、统计学分析

应用SPSS 13.0软件进行统计学分析。多组计数资料采用χ2检验，理论频数1≤T<5，计算校正χ2值，P<0.05为差异有统计学意义，多组计数资料两两比较采用P值修正的方法，即三组之间两两比较P<0.05/3=0.0167认为差异有统计学意义。

结 果

一、基本情况

纳入分析的118例Mtb菌株中，H耐药株85例，R耐药株99例，MDR株66例。男性85例，占72.03%(85/118)，女性33例，占27.97%(33/118)。年龄11～88岁，平均年龄42±11.28岁。患者分别来源于成都地区47例(39.83%，47/118)，三州地区32例(27.12%,32/118)，四川其他地区14个地级市共计39例(33.05%,39/118)。

二、H耐药相关基因katG、inhA基因突变位点与表型耐药水平的关系

H耐药株85例中，单基因耐药株84例(98.82%,84/85),其中katG71例(84.52%，71/84)、inhA13例(15.48%，13/84)。双基因耐药株1例(1.18%,1/85)。总体高浓度耐药(高耐药)71例(83.53%，71/85)，低浓度耐药(低耐药)14例(16.47%，14/85)。不同单基因突变位点耐药水平比较，katG与inhA高耐药率分别为92.96%(66/71)、30.77%(4/13)，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。双基因耐药株1例为高耐药(见表1)。

表1 katG、inhA单基因位点与表型耐药水平的关系

三、R耐药相关基因rpoB基因突变位点与表型耐药水平的关系

R耐药株99例中，单基因耐药株95例(95.96%,95/99),其中ropB531位点49例、ropB526位点22例、ropB533/516/513/511位点24例。双基因耐药株4例(4.04%,4/99)。总体高耐药77例(77.78%，77/99)，低耐药22例(22.22%，22/99)。不同单基因突变位点耐药水平比较，rpoB531、rpoB521、rpoB533/516/513/511高耐药率分别为93.88%(46/49)、81.82%(18/24)、37.5%(9/24)，三者比较差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较中，ropB531与ropB533/516/513/511 及ropB526与ropB533/516/513/511 比较高耐药率，差异均有统计学意义(P<0.0167)；ropB531与ropB526 比较差异无统计学意义(P>0.0167)。双基因耐药株4例均为高耐药(见表2)。

表2 rpoB单基因位点与表型耐药水平的关系

四、katG、inhA和rpoB基因位点突变频率

118例患者标本进行耐药基因突变位点统计，芯片法检测H耐药株85例中katG基因315单位点突变率最高达84.43%(71/85)，其次为inhA基因-15单位点13.93%(13/85)，最低为双基因katG315+inhA-15位点1.64%(1/85)。R耐药株99例中基因位点突变率从高到低依次为ropB531单位点49.50%(49/99)、ropB526单位点22.22%(22/99)、ropB511单位点11.11(11/99)、ropB516单位点8.08(8/99)、ropB533单位点3.03(3/99)、ropB513单位点2.02(2/99)；双基因和多基因位点突变率分别为3.03%(3/99)、1.01(1/99)。MDR株66例中耐药基因位点突变率从高到低依次为katG315+ropB531位点43.94%(29/66)、katG315+ropB526位点21.21%(14/66)、katG315+ropB511位点6.06%(4/66)及inhA+ropB5316.06%(4/66)、katG315+ropB533位点4.55%(3/66)及katG315+ropB516位点4.55%(3/66)及inhA+ropB526位点4.55%(3/66)、katG315+ropB513位点1.52%(1/66)；多基因位点突变率7.58%(5/66)(见表3)。

表3 katG、inhA和rpoB基因位点突变频率

讨 论

异烟肼耐药相关基因katG和inhA的耐药水平比较

Mtb的耐药主要是药物作用靶基因突变引起的。H耐药主要途径：H需要经Mtb触酶-过氧化物酶活化后才发挥作用，该酶由katG基因所编码，katG基因突变导致90%以上的H耐药株产生，其最普遍的变异发生在第315位点上，表型耐药水平为中等到高水平耐药[9]。本文中katG基因高浓度耐药率92.96%明显高于inhA基因30.77%，与其他研究者耐药水平略有差异，但总体一致[10-11]，说明katG基因有总体耐药水平高的特点。但该位点71株中仍有5株为低浓度耐药，提示katG基因其他位点上存在变异，导致Mtb对H产生不同水平的耐药性和保留不同的触酶-过氧化物酶活性。其次途径：inhA基因的调节序列上发生单碱基插入变异时，使inhA蛋白过度表达从而使H活性不同程度的降低，导致10%左右的H耐药株产生，其表型耐药水平大多数为低水平耐药[9]，本次研究中inhA低耐药率69.23%(9/13)也证实了这一特点。本文inhA-15位点13株中仍有4株为高浓度耐药，提示inhA基因低耐药有不稳定性的特点。 此外双基因katG+inhA突变株也为高浓度耐药，提示当单独存在katG基因突变或inhA启动子合并katG基因突变时耐药水平较高，表明高剂量异烟肼是无效的，因此在MDR-TB和RR-TB患者中，不应使用全口服MDR-TB短程方案[12]。本地区katG、inhA基因突变位点总体高浓度耐药率达 83.53%,也进一步提示本地区使用高剂量异烟肼必须结合快速分子药敏检测，在H敏感或低浓度耐药时才能慎重使用。

利福平耐药相关基因ropB各突变位点耐药水平比较

R耐药主要途径：R与MtbDNA依赖的RNA聚合酶β亚单位(ropB)结合后抑制其活性导致细胞死亡。β亚单位由ropB基因编码，其核心保守区域出现突变造成97%的R耐药株产生，最集中的突变位于531或526位点，并导致高度耐药，而511、516、518和522位点与低水平耐药相关[13]。本文中ropB531、ropB526高浓度耐药率分别为93.88%、81.82%，两者高耐药水平相似，无统计学差异，但均远高于rpoB511/513/516/533位点耐药水平，此外双基因3株及多基因1株突变株全部为高浓度耐药，均与ropB531、ropB526位点突变有关。6位点总体高耐药率达77.78%，提示本地区R耐药位点耐药水平高，临床使用必须规范 治疗同时加强药敏检测，避免耐药产生。

katG、inhA和rpoB基因位点突变频率比较

本研究收集的住院患者来自四川省各地，成都地区、三州边远地区、四川其他地区分别占39.83%、27.12%、33.05%，能较好代表四川地区地域分布特点。在耐药基因位点突变频率分布中发现：四川地区H耐药相关基因以单基因突变为主，katG主要突变形式为(AGC→ACC) Ser→Thr(S315T),占H耐药突变株的84.43%，其次为inhA突变率13.93%，双基因突变率仅有1.64%； R耐药相关基因rpoB也以单基因突变为主，主要突变形式为RRDR-531(TCG→TTG) Ser→Leu,占R耐药突变株的55.81%，其次为526、511位点突变率分别为13.95%、11.11%，双基因及多基因位点突变率仅有4.04%；MDR耐药相关基因主要突变形式为katG315+ropB531，占MDR耐药突变株的43.94%。这与扬州、深圳、海南等地区频率分布不尽相同，提示katG、inhA和rpoB基因位点突变频率分布存在地域性差异[14-16]。

总之，四川地区H、R耐药株的耐药水平高，基因突变位点与耐药水平密切相关。katG、rpoB531/526与H、R 高耐药水平有关，inhA、rpoB511/513/516/533与H、R 低耐药水平有关。katG315、rpoB531是H、R耐药相关基因突变的主要形式，临床使用抗结核药物须密切结合快速药敏检测制定方案。本次研究由于样本量局限未能进一步研究突变频率较少的H、R耐药相关基因位点对不同表型耐药水平的影响，希望在以后进一步开展相关研究。