高植物甾醇玉米油改善高脂血症金黄地鼠的胆固醇代谢

陈 鑫，王黎明,2，肖 杰，牛兴和, 2，王翔宇,2，尚嘉毅, 2，孙东哲, 2，应 剑, 2

(营养健康与食品安全北京市重点实验室；老年营养食品研究北京市工程实验室；中粮营养健康研究院有限公司1，北京 102209) (江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心2，南京 210023)

植物甾醇是一类以环戊烷全氢菲为主体骨架、3位羟基的甾体化合物，包括β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇，植物甾醇广泛存在于各类植物油、坚果以及蔬菜水果中[1]。常见食用油中，植物甾醇质量分数为2 451.2～10 320.7 mg/kg，玉米油中植物甾醇含量尤为丰富，在7 700 mg/kg以上[2]。植物甾醇在结构上与胆固醇类似，在人体内也通过胆固醇吸收蛋白(Niemann Pick C1 like 1，NPC1L1)进行转运[3]。因此，植物甾醇可竞争性抑制人体肠道对外源性胆固醇和内源性胆固醇的吸收，从而起到降低血液胆固醇的作用[4]。近年来的研究发现，植物甾醇改善血脂的作用机制还与调节肠道菌群相关。肠道菌群与营养素的消化吸收、营养代谢、人体免疫应答以及肥胖等疾病均密切相关[5, 6]；其结构和功能受宿主遗传、饮食等因素的影响[7, 8]。研究表明，在金黄地鼠的饮食中添加5%的用硬脂酸酯化的植物甾醇酯，可以促进厚壁菌门菌的增殖，抑制放线菌门菌的增殖，从而发挥抑制胆固醇吸收、促进胆固醇合成、降低血浆非高密度脂蛋白胆固醇(Non high density lipoprotein cholesterol, non-HDL)和肝脏游离胆固醇的作用[9, 10]。

由于血清中高水平的总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇是冠心病和脑卒中等心脑血管疾病的独立危险因素之一，因此植物甾醇可作为功能性原料添加至食品中，以降低动脉粥样硬化和心血管疾病的风险[11-13]。《中国成年人血脂异常防治指南—2007版》指出，每天补充2 g植物甾醇可降低血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇的水平。每天食用1.5～3 g植物甾醇大致可降低约10%的低密度脂蛋白胆固醇[14, 15]。从植物油中直接摄入植物甾醇是最为有效便捷的补充植物甾醇的方式之一，也更为符合人们的饮食习惯。根据《中国居民膳食指南(2016)》推荐成人每天烹调油摄入量为25～30 g计算，通过食用含有17 000 mg/kg植物甾醇的玉米油可摄入0.4～0.5 g的植物甾醇；因此高植物甾醇玉米油是摄入植物甾醇的重要食物来源。目前，植物甾醇调节脂质代谢以及肠道菌群的研究主要针对提纯的植物甾醇粉类制剂或植物甾醇酯类制剂[16, 17]，富含植物甾醇的植物油是否具有调节血胆固醇水平和肠道菌群的作用鲜见报道。

为探究富含植物甾醇的玉米油对高脂血症及其并发症的改善作用，本研究选用对胆固醇高度敏感的叙利亚金黄地鼠作为实验动物[18]，其血脂形态、肝脏合成胆固醇和胆汁酸的作用机制与人类似[19]，能更好地反映人类脂质代谢的调节。通过高脂高胆固醇饮食诱导金黄地鼠产生高脂血症，利用富含天然来源植物甾醇的玉米油对金黄地鼠进行干预，并同时设置了橄榄油干预组和添加人工合成植物甾醇粉的阳性对照组作为对照，考察富含植物甾醇的玉米油对体重、血脂、动脉硬化指数、肠道菌群的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物和实验材料

清洁级8 周龄雄性叙利亚金黄地鼠(LVG Golden Syrian Hamster)50只，体重(123.2±8.4)g，生产许可证号：[SCXK(京)2021-0006]。动物饲养于北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：[SCXK(京)2019-0008]的清洁级动物房。实验动物的使用坚持3R原则，并得到北京华阜康生物科技股份有限公司实验动物使用和管理委员会的批准(批准号：IACUC-20201110)。清洁级动物房饲养条件为室温(24±2)℃，相对湿度40%～60%，12 h人工照明/黑暗循环，换气次数 15次/h。金黄地鼠进入动物房先进行适应性饲养，自由摄食并饮水，适应1周后进行实验。

低植物甾醇玉米油和高植物甾醇玉米油均为市售，生产许可证编号：[SC10232062300145]，植物甾醇粉为市售。油中脂肪酸和植物甾醇含量见表1，脂肪酸检测方法按照GB 5009.168—2016检测，植物甾醇检测方法按照GBT25223—2010检测。

表1 玉米油和橄榄油中脂肪酸和植物甾醇质量分数

地鼠维持饲料为基础饲料；高脂高胆固醇饲料：90%基础饲料+9%玉米油(或橄榄油)+1%胆固醇。

1.2 材料与仪器

1.2.1 实验试剂

无水乙醇、二甲苯、30%过氧化氢、高效切片石蜡、HE染液、分化液、苏木素染液、返蓝液、油红染液、封片剂，所用试剂均为分析纯。

1.2.2 仪器与设备

AU480全自动生化仪，JJ-12J脱水机，JB-P5包埋机，RM2016病理切片机，CRYOSTAR NX50冰冻切片机，LEICA 819切片刀，KD-P组织摊片机，GFL-230烤箱，Nikon Eclipse E100正置光学显微镜，NIKON DS-U3成像系统。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组

金黄地鼠随机分为5组，每组10只，以饲喂基础饲料组动物为空白对照组(BC)，以饲喂低植物甾醇玉米油制作的高脂高胆固醇饲料组动物为模型对照组(MC)，以饲喂高植物甾醇玉米油制作的高脂高胆固醇饲料组动物为玉米油干预组(CI)，以饲喂橄榄油制作的高脂高胆固醇饲料组动物为橄榄油干预组(OI)，以饲喂添加0.5%植物甾醇粉制作的高脂高胆固醇饲料组动物为阳性对照组(PC)。地鼠自由摄食饮水，预防性干预10周，记录各组动物每周的体重、摄食量。计算干预第10周相比干预第0周动物体重增长率(图1)。同时，记录整个干预周期金黄地鼠平均摄食量，根据饲料中所含植物甾醇含量换算得到地鼠每日植物甾醇摄入量，根据饲料能量换算地鼠每日能量摄入量(表2)。

表2 实验分组

式中：M1为干预第0周体重；M2为干预第10周末体重。

1.3.2 组织取材

干预10周末期，组织取材之前，各组动物禁食12 h，禁食期间，保持正常饮水。取材当天，摘眼球收集血液于离心管中室温静置10 min，3 000 r/min离心5 min后，取血清分装冻存于-80 ℃冰箱，用于后续各项指标检测。采血后安乐死动物，取完整肝脏、肾脏、睾周脂肪、肾周脂肪等，用生理盐水漂洗后，滤纸擦干称质量，用于计算脏器指数(表4)。脏器指数=m/M，

式中：m为脏器质量/g，M为动物取材时体重/g。取结肠部位肠道内容物用于后续肠道菌群检测分析。

1.3.3 血清生化指标检测

干预10周后，检测金黄地鼠血清总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)(图2)。检测方法依次为：TC(氧化酶法)、TG(氧化酶法)、HDL-C(直接法)、LDL-C(直接法)、AST(紫外-苹果酸脱氢酶法)、ALT(紫外-乳酸脱氢酶法)，生化指标均采用美国贝克曼全自动生化仪检测系统检测。其中动脉硬化指数(AI)由TC和HDL-C值换算获得，计算公式为：

1.3.4 肝脏生化指标检测

动物肝脏组织经准确称量，按质量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例，加入9倍体积的无水乙醇，冰水浴条件下机械匀浆，制成10%的匀浆液，在转速为2 500 r/min条件下离心10 min，取上清测定。肝脏总甘油三酯(GPO-PAP酶法)、总胆固醇(COD-PAP法)、游离脂肪酸(ACS-PAP法)均采用生化测试盒测定，经酶标仪检测吸光度计算浓度。

1.3.5 脏器组织切片检查

肝脏组织HE染色按照顺序制片：取材、固定、漂洗、脱水、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、HE染色、脱水透明、封片，在显微镜下观察病理病变。肝脏组织油红O染色按顺序制片：取材、新鲜冰冻切片固定、油红染色、背景分化、苏木素染色、封片，于显微镜下镜检，进行病理观察。

1.3.6 肠道菌群检测

使用细菌 DNA 提取试剂盒(TruSeq TM DNA Sample Prep Kit)提取金黄地鼠肠道内容物中的细菌基因组，经NanoDrop2000测定选择 DNA 浓度为 20 ng/μL 的样本进行下一步 PCR扩增。基因组通过PCR进行扩增得到细菌16S rRNA 基因的V3-V4 区。扩增子经 2%琼脂糖凝胶电泳后凝胶回收提取，使用AxyPrepDNA 凝胶提取试剂盒按照制造商的说明进行纯化，并使用QuantiFluorTM-ST(Promega)进行定量。纯化后的扩增子汇集在等分子量的测序池中，使用 Illumina MiSeq 进行配对测序(2×PE300)。原始 fastq 文件使用QIIME1.9.1进行质量过滤。具有 97%相似性的序列通过 UPARSE(版本7.0.1090)聚类为一个操作单元(OTU)，并使用 UCHIME 识别和去除嵌合体序列。利用 RDP 分类器(版本11.5)对置信阈值为 70%的 silva(SSU115)16S rRNA 数据库中每个 16S rRNA 基因序列的系统发育亲缘关系进行分析及注释。

1.3.7 数据统计分析

所有数据结果以平均值±标准差表示，使用GraphPad Prism 9.0 作图，两组间进行t-test检验，多组间进行One way ANOVA统计学分析。

2 结果与分析

2.1 高植物甾醇玉米油对金黄地鼠体重增长率、平均摄入能量的影响

各组金黄地鼠饮食干预10周体重增长率如图1所示，整个干预周期地鼠平均摄食量、平均摄入甾醇量和平均摄入能量如表3所示。玉米油组和阳性对照组动物每日摄入植物甾醇显著高于模型对照组(P<0.000 1)，与植物甾醇是不同实验组地鼠饮食中的主要差异成分有关。干预第10周，与模型组动物相比，高植物甾醇玉米油干预后，金黄地鼠体重增加减缓，体重增长率由模型组的(36.4±18.5)%降至玉米油组的(21.5±12.2)%；下降幅度达40.9%，显著高于阳性对照组(P<0.05)和橄榄油组(P<0.01)。

玉米油组摄入的能量值显著低于模型对照组(P<0.05)，而阳性对照组和橄榄油组摄入能量较高，对于体重增长率的差异有一定的贡献。本实验体重增长率变化规律与其他研究一致[20]，验证了高植物甾醇玉米油可以降低体重增长率。

注：*表示与玉米油组相比统计学差异显著，*P<0.05，**P<0.01。图1 各组干预后对金黄地鼠体重增长率的影响

2.2 高植物甾醇玉米油对金黄地鼠脏器指数的影响

各组金黄地鼠饮食干预10周，解剖地鼠准确称量各脏器质量，脏器指数结果如表4所示。与空白对照组相比，模型对照组动物肝脏指数显著升高(P<0.000 1)，玉米油组动物的肝脏指数有一定程度下降(P=0.328 9)，但并不显著。肝脏指数的增加，主要与摄入高脂高胆固醇饮食导致甘油三酯在肝脏堆积有关，该实验结果与其他研究结果一致[9, 20]。各组肾脏指数、肾周脂肪指数和睾周脂肪指数均无显著性差异。

2.3 高植物甾醇玉米油干预对金黄地鼠生化指标的影响

各组金黄地鼠饮食干预10周后，收集金黄地鼠血清，检测血脂指标如图2a～图2d所示，检测肝功指标如图3所示。与空白对照组相比，模型对照组TC、HDL-C、LDL-C均显著升高(P<0.000 1)，TG也有一定程度的升高，但不显著(图2a、2b、2c、2d)。与模型对照组相比，玉米油组血清TC和LDL-C显著降低(P<0.05和P<0.000 1)，分别降低19.1%和45.5%，且效果均优于橄榄油。LDL-C/HDL-C是心血管疾病重要的危险因素之一，对各组金黄地鼠LDL-C/HDL-C统计发现，和空白对照组相比，高脂高胆固醇饮食升高LDL-C/HDL-C，而高植物甾醇玉米油可显著降低LDL-C/HDL-C水平(P<0.01)，玉米油组的LDL-C/HDL-C水平较模型对照组降低40.6%，且效果优于橄榄油组和阳性对照组(图2e)。

表3 各组干预后对金黄地鼠整个干预期平均摄食量、平均摄入甾醇量和平均摄入能量的影响

表4 各组干预后对金黄地鼠脏器指数的影响

注： *表示各组与模型对照组相比统计学差异显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1。

动脉硬化指数结果如图2f所示。模型对照组和空白对照组相比，AI值显著升高(P<0.001)，提示高脂高胆固醇饮食引起动脉硬化风险升高。玉米油组、橄榄油组以及阳性对照组均能显著降低AI值，其中玉米油组较模型组降低29.5%，优于其他干预组。玉米油组AI值与空白对照组相比无显著性差异(P>0.05)，玉米油组AI值基本恢复到空白对照组水平(图2f)。表明高植物甾醇玉米油具有降低因高脂高胆固醇饮食引起的动脉硬化风险的作用。

如图3所示，各组干预后ALT和AST无明显变化，表明高植物甾醇玉米油对于肝脏功能影响不大，具有较好的安全性。

图3 各组干预后对金黄地鼠肝功指标的影响

摄入高植物甾醇的玉米油有助于改善血脂状况，可能降低动脉硬化的风险。根据体表面积换算，相当于70 kg成人每天摄入860 mg植物甾醇。Ostlund等[2]发现，对健康人群每餐给予含150 mg植物甾醇的玉米油可降低12.1% TC，每餐给予含300 mg植物甾醇的玉米油可降低27.9%的TC，与本研究结果一致。LDL-C结果与Reaver等[1]对健康人群每天给予1.5 g植物甾醇可降低10.2%的LDL-C结果较为一致。由此可见，高植物甾醇玉米油对于血脂异常，特别是血胆固醇异常的人群是潜在的健康食用油，在降低血胆固醇方面具有积极的健康作用。

2.4 高植物甾醇玉米油对金黄地鼠肝脏的影响

肝脏形态观察是解剖金黄地鼠后对其肝脏组织颜色、质地、性状等的观察。空白对照组金黄地鼠肝脏颜色红润、质韧、边缘锐利。模型对照组组金黄地鼠肝脏体积增大、呈黄色、油腻感，边缘变钝，呈现明显的脂肪肝病变。玉米油组、橄榄油组和阳性对照组也均出现同模型对照组类似的脂肪肝病变现象，但各干预组干预后均未发现脂肪肝有明显的改善作用。

金黄地鼠肝脏切片HE(Hematoxylin-Eosin staining)染色结果如图4所示。高脂高胆固醇饮食诱导后，金黄地鼠肝组织中广泛可见大量肝细胞脂肪变性，细胞肿胀，胞质中可见微小的圆形空泡，组织中可见较大量的泡沫细胞与少量淋巴细胞浸润，局部可见少量出血。各干预组的肝脏组织无明显改善。油红O染色结果显示，空白对照组无明显脂肪液滴，细胞核清晰可见，模型对照组肝脏组织广泛可见大量肝细胞胞质中有大小不一的脂肪液滴；各组干预后，均无明显改善。

注：a、b、c、d、e分别为BC、MC、C1、O1、PC,1和2分别为HE和油红。图4 各组干预后对金黄地鼠肝脏病理的影响

注：*表示各组与模型对照组相比统计学差异显著，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1。图5 各组干预后对金黄地鼠肝脏生化指标的影响

动物肝脏生化指标总胆固醇结果如图5所示。与模型对照组相比，玉米油组TC有一定程度降低(P=0.18)，但未到达统计学差异，与血清中TC变化规律一致；玉米油组TG与模型组相比无显著差异，而橄榄油组TG水平酵模型组显著升高(P<0.05)。模型组肝脏中的游离脂肪酸(FFA)较空白组有一定程度升高，摄入植物甾醇粉显著降低FFA水平，但玉米油和橄榄油干预未见这一作用。

由此可见，高脂高胆固醇饮食会引起肝脏中脂肪大量堆积，进一步发展为脂肪变性、脂肪肝。使用高植物甾醇玉米油、橄榄油、植物甾醇粉干预后对于脂肪肝的改善均不明显或未有改善作用。高植物甾醇玉米油仅表现出对降低肝脏总胆固醇有一定作用，但未能改善甘油三酯和游离脂肪酸水平，而单独摄入植物甾醇可显著降低肝脏总胆固醇和游离脂肪酸水平，表明从植物油中摄入植物甾醇，不能忽视油脂作为宏量营养素对于机体的整体影响。

2.5 高植物甾醇玉米油对金黄地鼠肠道菌群的影响

Chao指数(图6a)和Shannon指数(图6b)分别用来评估物种的丰富度和多样性。结果显示，和空白对照组相比，模型对照组肠道菌群物种多样性有一定程度的下降；玉米油组和橄榄油组与模型对照组相比，肠道菌群多样性有一定程度升高，但未达到显著性差异。肠道菌群丰富度方面，除橄榄油组有一定程度升高外，其他各组基本维持在同一水平。

图6 各组干预后对金黄地鼠肠道菌群的影响

对各组金黄地鼠肠道菌群进行PCA(Principal Component Analysis)分析(图6c)。结果表明，PCA1、PCA2分别为23.67%、16.38%，空白对照组聚集在坐标中的中间偏上位置，模型对照组聚集在坐标轴中间偏下的位置，说明高脂高胆固醇饮食对于金黄地鼠肠道菌群结构有一定影响。玉米油组、橄榄油组和阳性对照组在模型对照组和空白对照组之间。由此可见高植物甾醇玉米油和橄榄油均可定向改变肠道菌群结构，但未能完全逆转由于高脂高胆固醇饮食引起的肠道菌群的改变。

对金黄地鼠肠道菌群的门水平进行分析(图6g)，肠道菌群在门水平上主要由厚壁菌门Firmicutes、拟杆菌门Bacteroidetes、脱硫杆菌门Desulfobacterota构成。与空白对照组相比，模型对照组厚壁菌门和脱硫杆菌门丰度有一定程度上升，拟杆菌门丰度有一定程度下降，而且肠道菌群中厚壁菌门和拟杆菌门的比例(F/B)异常增加(图6d)。经高植物甾醇玉米油干预后，厚壁菌门和脱硫杆菌门有所下降，拟杆菌门有所上升(图6e)，F/B也有所下降，肠道菌群有一定程度的改善，但尚未达到统计学差异。与玉米油组不同，橄榄油组厚壁菌门有所下降(图6d)，拟杆菌门有所上升(图6e)，但脱硫杆菌门的丰度也相应升高(图6f)。将血液生化指标和动脉硬化指数同肠道菌群(门水平)进行相关性分析，结果表明，与TC、TG和AI指标呈正相关的菌包括脱硫杆菌门Desulfobacterota、放线菌门Actinobacteriota、破伤风杆菌门Patescibacteria、弯曲杆菌门Campilobacterota等。与TC、TG和AI指标呈负相关的菌包括拟杆菌门Bacteroidota，疣菌群门Verrucomicrobiota等(图7)。

厚壁菌门和拟杆菌门是人体肠道中的优势菌群之一，肠道菌群中厚壁菌门丰度的增加有利于能量的吸收，更容易导致机体的肥胖[21, 22]，肠道菌群中的拟杆菌门与肥胖密切相关，Ley等[6]的研究发现在ob/ob肥胖小鼠中，拟杆菌的丰度可减少50%以上，同样肥胖人群的肠道菌群中拟杆菌丰度也更低。高植物甾醇玉米油通过降低肠道菌群中厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度，可能抑制动物对能量的摄取、减缓脂肪的生成和蓄积，对降低动物体重增长率有一定的贡献[16]。脱硫杆菌门与脂多糖(Lipopolysaccharide , LPS)的产生有关，而LPS能够促进IL-6(Interleukin-6)和IL-8(Interleukin-8)的分泌[23]，诱发炎症反应。炎症反应不仅与动脉粥样硬化的发生发展有关，而且与动脉粥样硬化的多种并发症的发生密切相关[24]。脱硫杆菌还可促进参与脂质吸收的受体CD36的表达，进而调节宿主的脂质吸收能力，最终影响宿主体重[25]，促进宿主肥胖[26]。高植物甾醇玉米油可能通过降低脱硫杆菌进而降低了血清胆固醇，进而改善血脂指标、降低动脉硬化指数和动脉粥样硬化风险。

将血液生化指标(包括TC、TG、AI、ALT和AST)同肠道菌群(属水平)进行相关性分析。与TC、TG呈正相关的菌包括脱硫弧菌属Desulfovibrio、norank_f_Desulfovibrionaceae，梭菌属Lachnoclostrdium，毛螺菌属Lachnospiraceae_NK4A136_group、Lachnospiraceae_UCG_006、norank_f_Lachnospiraceae等。而与TG、TC呈负相关的菌包括嗜黏蛋白阿克曼菌Akkermansia，拟杆菌属Bacteroides、Parabacteroides、Alistipes，乳杆菌属Lactobacillus等。与AI呈正相关的菌为瘤胃球菌属Ruminococcus，而与AI呈负相关的菌包括Ileibacterium菌属。模型对照组的脱硫弧菌属、梭菌属、毛螺菌属均比空白对照组升高，尚未达到统计学差异；与模型对照组相比，玉米油组脱硫弧菌属、梭菌属、毛螺菌属均有不同程度下降，橄榄油组菌属均有不同程度上升，但均未达到统计学差异。

图7 相关性分析(门水平)

3 结论

高植物甾醇玉米油对于高脂高胆固醇饮食诱导的高脂血症金黄地鼠模型具有降低体重增长、改善胆固醇代谢、降低动脉硬化风险以及调节肠道菌群的作用。食用该玉米油10周之后，金黄地鼠体重增长率下降40.9%，血总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇分别下降19.1%和45.5%，肝脏总胆固醇下降23.1%，肝脏指数下降8.5%，动脉硬化指数下降29.4%。其作用机制与高植物甾醇直接抑制胆固醇的吸收以及抑制肠道脱硫杆菌的丰度，从而改善胆固醇代谢有关。但是，由于食用油中的主要宏量营养素为脂肪，食用高植物甾醇玉米油不能改善甘油三酯水平。

高植物甾醇玉米油与橄榄油相比，植物甾醇和脂肪酸含量差异均较大。本研究中橄榄油与低植物甾醇玉米油相比，在降低LDL-C和动脉硬化指数方面有明显优势，可能与橄榄油中富含油酸直接相关。高植物甾醇玉米油在降低体重增长、血总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、动脉硬化指数以及改善肠道菌群等方面的作用均优于橄榄油，推测是植物甾醇而不是脂肪酸起到了主导调节血脂、降低体重、改善肠道菌群的作用。