循环血microRNA表达谱分析在慢性阻塞性肺疾病相关肺动脉高压中的应用研究

蔡茜 朱应群 陈思睿 李喆

肺动脉高压(pulmonary hypertension，PH)是能在多种临床疾病中出现的一个血流动力学和病理生理状态。其主要特点是肺动脉阻力进行性增高，从而引起右心负荷增高，最终导致右心衰竭甚至死亡。PH是一种具有潜在致命性的疾病，若未能及时诊断、干预将严重影响生活质量，大部分的患者预后很差[1,2]。在肺部疾病和(或)低氧所致PH中，慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)为最常见的病因。COPD可以通过多种机制导致PH，目前数据与临床观察表明COPD患者长期的慢性炎症和慢性缺氧是导致PH的主导因素[3,4]。COPD合并PH患者在早期，症状往往被肺部疾病本身所致胸闷、呼吸困难症状重叠而被掩盖，导致患者在诊断治疗方面不够及时[5]。作为诊断PH金指标的右心导管术(right heart catheterization,RHC)是一种有创检查，可能引起一系列并发症，还受到患者经济情况、医院设备、医师水平的制约，因此并不能成为常规检查手段进行推广。超声心动图是筛查COPD合并PH患者的最佳无创检查方法，但由于受到肺气肿干扰，仅有38%左右的患者能够通过检测三尖瓣反流面积以估测肺动脉收缩压，对于操作人员技术要求较高[6]。在治疗方面，指南中明确指出，不推荐肺部疾病和(或)低氧所致PH患者常规使用目前治疗PH的靶向药物[6]。综上所述，我们急需寻找一种无创、能早期诊断COPD相关PH的方法。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种内源性的小核酸片段，是一类在进化上高度保守的单链非编码小分子RNA 的统称，microRNA可以通过抑制mRNA的翻译或促进mRNA的降解对其靶基因的表达发挥调控作用，具有调控细胞增殖、凋亡、分化的功能[7]。循环血microRNA符合作为生物标记物的大部分特点，如取样方便，在血浆中稳定存在，在病理状态下可出现明显差异性表达，并且检测手段成熟，并且在疾病状态下其表达丰度可出现显著变化，可以用作疾病的生物标记物。目前microRNA表达谱在COPD及合并PH中现状尚不清楚，本研究希望通过对于COPD相关PH中差异性表达的microRNA进行筛选，建立该疾病的microRNA表达谱，寻找该疾病的新的生物标志物，为该疾病的早期诊断和治疗提供分子生物学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年12月至2020年11月我院呼吸内科门诊随诊的稳定期COPD合并PH患者20例(PH组)，按年龄、性别、体重、吸烟情况匹配的呼吸科门诊随诊的COPD稳定期不合并PH的患者20例(NPH组)。患者均符合慢性阻塞性肺疾病全球倡议(GOLD2020)的COPD的诊断标准。患者均经超声心动图检查以三尖瓣反流法测算肺动脉收缩压，PH组患者均符合2015年欧洲心脏病学会(ESC)与欧洲呼吸学会(ERS)《肺动脉高压诊断与治疗指南》中PH诊断标准[1]。 2组患者年龄、性别比、吸烟指数、体重指数差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有标本采集前均书面告知患者知情同意，获得医院伦理委员会批准(2018-KL-020)。见表1。

表1 2组患者一般资料比较 n=20

1.2 排除标准 (1)其他原因例如心脏原因引起的PH以及原发性PH等；(2)排除心血管疾病、消化系统疾病及遗传代谢性疾病；(3)其他肺部疾病如肺结核、肺癌、支气管扩张等。

1.3 方法

1.3.1 肺功能检查：患者在肺功能室进行肺功能检查，检查前24 h内未使用β受体激动剂、糖皮质激素、抗胆碱能药物及茶碱类药物。主要检查指标为：FEV1/FVC及FEV1占预计值百分比(FEV1%)。

1.3.2 肺动脉压力测定：患者进行超声心动图和多普勒超声检查，三尖瓣峰值流速>3.4 m/s 或肺动脉收缩压>50 mm Hg诊断为PH[1]。

1.3.3 血浆总RNA的提取：以空管分别收集2组各外周静脉血约10 ml，离心(4℃，2 500 r/min，15 min)获得血浆标本，使用 TRIzol法提取血浆总RNA。样本放-80℃冰箱保存。

1.3.4 血浆microRNA表达水平：随机选取每组5个样本以高通量测序法检测，根据差异倍数(FC>2)及P值(P<0.05)筛选出上调表达或下调表达的microRNA。

1.3.5 qRT-PCR 验证：取各组余下15个血浆标本，纯化后测定RNA浓度，以电泳方法检测RNA的完整性。选择相应引物，用 Poly(A)加尾法、实时定量聚合酶链反应(quantitative real time-polymerase chain reaction， qRT-PCR)法对高通量测序法筛选出的表达差异性显著的microRNA进行验证。

1.3.6 靶基因预测：根据相关文献及本实验结果，选取其中显著下调的miR-150-5p，通过TargeterScan、miRDB、TarBase数据库对其进行靶基因预测，对3个数据库预测到的靶基因取交集，找出与miR-150-5p有靶向关系的基因。通过GO分析，研究miR-150-5p靶基因与相关分子通路的关系。

2 结果

2.1 建立COPD相关PH患者循环血中的microRNA异常表达谱 通过Fold change(FC)和P-value2组间的差异表达microRNA表达谱(Fold change>2.0倍变化且P<0.05)。筛选出88个表达量上调的microRNA，109个表达量下调microRNA。见图1。

图1 差异表达的microRNA表达谱;当前选定的阈值为|log2(Fold Change)|>2 & pvalue<0.05，满足这一阈值的个数有197个，其中高表达(蓝点表示)有88个，低表达(红点表示)有109个

2.2 microRNA差异性表达结果 取各组余下的15个血浆标本，qRT-PCR验证上述高通量测序法检测的结果。对其中miR-21-3p、miR-423-3p、miR-370-5p、miR-409-5p、miR-483-3p、miR-150-5p、miR-345-3p、miR-122-5p采用qRT-PCR进行验证，内参选用U6。结果表明，与单纯COPD组(NPH组)比较，上调基因miR-21-3p、miR-423-3p，下调基因miR-409-5p、miR-483-3p、miR-150-5p的表达差异均有统计学意义(P<0.05)，而miR-370-5p、miR-345-3p、miR-122-5p的表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、3，表2、3。

图2 上调的microRNA相对表达量，其相对表达量用2-△△CT表示

图3 下调的microRNA相对表达量，其相对表达量用2-△△ CT表示

表2 下调表达的microRNA比较

表3 上调表达的microRNA比较

2.3 miR-150-5p靶基因预测 选取其中显著下调的miR-150-5p，通过TargeterScan、miRDB、TarBase数据库对其进行靶基因预测，对3个数据库预测到的靶基因取交集，通过TargeterScan、miRDB、TarBase数据库对其进行靶基因预测，对3个数据库预测到的靶基因取交集，(EGR2、EP300、MBD6、MDM4、MLXIP、MTCH2、MYB、NFASC、PDE7A、PTP4A1、SP1、ZEB1)。经过查询相关数据和文献发现[8-15]，其中EP300、MDM4、MYB、NFASC、PDE7A、PTP4A1、SP1、ZEB1与肺部疾病之间的关系较为密切。这些miR-150-5p通过这些靶基因参与多个分子信号通路的调节，包括锌指蛋白、转录因子、ATP耦联的离子型通道受体等。见图4、5，表4。

图4 hsa-miR-150-5p在3种不同数据库中靶基因预测结果

图5 hsa-miR-150-5p主要靶基因的GO生物过程

表4 hsa-miR-150-5p靶基因的GO分析(前五位)

3 讨论

研究发现，microRNA广泛表达于多种组织和器官，参与细胞的增殖和凋亡，免疫炎症，血管生成，肿瘤侵袭等过程，同一个microRNA可调控多个靶基因，而同一个靶基因也受多个microRNA的调控[16]。研究发现microRNA的靶基因(如BMPR2、RhoB，Mst1)在肺动脉高压的相关途径中高度富集，说明microRNA对于肺动脉高压的发生发展产生广泛影响[17]。不同的microRNA在肺动脉高压患者循环血中可表现上调或下调[18]。Zhang等[19]研究发现，miR-483在肺动脉高压疾病进程中起保护作用，相较正常人群，特发性肺动脉高压患者血清中miR-483水平显著降低，且与患者疾病严重程度具有相关性，疾病严重程度越高者miR-483水平越低。通过生物信息学分析证实，miR-483与包括TGF-β，TGFBR2、β-catenin、CTGF、IL-1β、ET-1在内的多个肺动脉高压相关基因具有相关性。有研究发现，miR-21在香烟烟雾诱导的 COPD 小鼠模型的肺组织中表达明显升高，特异性的miR-21 拮抗剂可降低miR-21的表达,抑制气道炎症和小气道纤维化[20]，另外,miR-21还能通过促进细胞凋亡和自噬参与COPD 的发展[21,22]，以上研究均表明 miR-21在COPD中发挥重要作用，但miR-21是否参与COPD相关PH 的发生和发展尚不清楚[23]。

本研究采用高通量测序法对COPD不合并PH患者以及COPD合并PH组患者循环血microRNA进行筛选，筛选出88个表达量上调的microRNA，109个表达量下调microRNA。结合相关文献，选出其中8个用qRT-PCR的方法进行验证。结果表明，与单纯COPD组(NPH组)相比，上调基因miR-21-3p、miR-423-3p，下调基因miR-409-5p、miR-483-3p、miR-150-5p的表达有显著差异。其中miR-21-3p、miR-483-3p、miR-150-5p在以往关于PH的研究中曾有报道[19,24-27]，但其与COPD相关PH的关系、作用机制仍待进一步探索和研究。本研究选择对显著下调的miR-150-5p进行进一步的靶基因分析，通过TargeterScan、miRDB、TarBase数据库对其进行靶基因预测，对3个数据库预测到的靶基因取交集，发现有14个靶基因在3个数据库中同时存在。通过GO分析及查阅文献发现，这些靶基因主要参与了它们主要参与了锌指蛋白、转录因子、ATP 耦联的离子型通道受体和细胞因子信号传导抑制蛋白等多种生物学过程[28]。其中E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)是一种转录调控因子，对于细胞的增殖有着正向调控的作用,在沉默肺鳞癌细胞的ZEB1后，肿瘤细胞的增殖和侵袭能力明显减慢[29]。磷酸二酯酶(phosphodiesterases,PDEs)作为体内特异性水解第二信使cAMP和cGMP的惟一蛋白酶家族，参与多种生理病理过程。PDE7是cAMP特异性的，可分为PDE7A、PDE7B两个亚型，其中PDE7A在肺和免疫细胞中大量存在，具有免疫炎症疾病靶点的意义，与COPD密切相关。PDE7抑制剂可能会通过影响中性粒弹性蛋白酶(NE)等的活性，增强PDE4抑制剂对COPD的疗效[30]。由抑癌基因TP53编码的p53是体内最重要的抑癌因子之一。MDM2/MDM4是p53的负向调控因子，通过p53-MDM2/MDM4负反馈环路调控p53的功能。几乎所有的肿瘤均存在p53的异常，主要包括p53突变和MDM2/MDM4扩增引起的p53失活[31]。

本研究筛选出来的14个候选基因，为后续进一步探索miR-150-5p在COPD相关PH中的调控机制提供了初步的研究方向。在后续的研究中，我们将加大样本量，并增加细胞及动物试验，逐个对上述存在差异性表达的microRNA与疾病的关系，调控方式等进行更深入的分析和探索。