巴豆生物碱调控miR-4317对结直肠癌SW620细胞增殖和凋亡的影响及机制

孔令甲 赵维波 刘英超 李培哲

结直肠癌是临床常见的一种消化系统恶性肿瘤，全球发病率较高，放化疗等治疗手段存在不良反应，多种天然药物具有安全性高、多靶点与不良反应小等特点，因而从中药与天然药物中寻找治疗结直肠癌的药物具有重要意义[1-4]。巴豆生物碱(crotonic alkaloids，CA)是从大戟科巴豆中提取的一种活性成分，研究表明巴豆生物碱可诱导卵巢癌细胞周期阻滞而抑制细胞增殖并可促进细胞凋亡[5]。但对于巴豆生物碱与结直肠癌相关研究报道笔者未见报道。微小RNA(microRNA，miRNA)可能通过靶向结合mRNA的3’UTR而抑制靶基因翻译或抑制其表达从而调节细胞生长及转移等生物学行为，研究表明miR-4317在乳腺癌组织和细胞中表达降低，过表达miR-4317可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[6]。而miR-4317在结直肠癌中的作用尚未可知。因此，本研究探讨巴豆生物碱对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响、miR-4317在结直肠癌的作用以及巴豆生物碱对miR-4317的调控作用，为结直肠癌治疗药物的研发提供新方向。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 巴豆生物碱购自武汉谷歌生物(纯度≥99%)；人结直肠癌细胞SW620购自武汉普诺赛生命；MTT、RNA提取试剂、凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen；反转录与荧光定量PCR试剂购自北京天根生化；miR-4317寡核苷酸模拟物(miR-4317 mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、miR-4317特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-4317)及其阴性对照(anti-miR-NC)购自广州锐博生物；兔抗人cleaved-caspase3、cleaved-caspase9抗体与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗购自美国Abcam。

1.2 方法

1.2.1 实验处理及分组：对数生长期SW620细胞(2×105个/ml)接种于6孔板(100 μl/孔)，待生长融合至70%时每孔加入不同浓度(25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml)巴豆生物碱的DMEM培养基培养24 h[7]，记为CA-L组、CA-M组、CA-H组；将正常培养的SW620细胞记为Con组。按照Lipofectamine2000说明书转染，miR-NC、miR-4317 mimics分别转染至SW620细胞，分别记为miR-NC组、miR-4317组。anti-miR-NC、anti-miR-4317分别转染至SW620细胞，转染成功后加入100 μg/ml巴豆生物碱处理24 h，分别记为CA+anti-miR-NC组、CA+anti-miR-4317组。

1.2.2 MTT检测细胞增殖：收集各组SW620细胞(2×104个/ml)接种于96孔板(100 μl/孔)，每孔加入MTT溶液20 μl，培养4 h后3 000 r/min转速离心5 min，弃上清，每孔加入150 μl DMSO，室温避光孵育5 min，酶标仪检测各孔吸光度值(A值)，细胞增殖抑制率=实验组A/Con组A。

1.2.3 平板克隆形成实验：收集各组SW620细胞接种于6孔板(500个/孔)，于37℃培养箱培养14 d，甲醇固定20 min，1%结晶紫染色液染色15 min，流动水洗涤后晾干，于显微镜下统计细胞(>50个为1个集落)克隆形成数。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率：收集各组SW620细胞加入预冷PBS洗涤，按照凋亡检测试剂盒说明书检测细胞凋亡率。

1.2.5 qRT-PCR检测miR-4317表达水平：提取各组SW620细胞总RNA，反转录合成cDNA，加入DEPC水稀释20倍后进行qRT-PCR反应，按照试剂盒说明书操作并应用罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪检测Ct值并采用2-ΔΔCt法计算miR-4317相对表达量。

1.2.6 Western blot检测cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达量：提取各组SW620细胞总蛋白，SDS-PAGE后转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入cleaved-caspase3(1∶1 000)、cleaved-caspase9(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)一抗稀释液4℃孵育24 h，加入二抗稀释液(1∶3 000)室温孵育1 h，滴加ECL显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

2 结果

2.1 巴豆生物碱对结直肠癌SW620细胞增殖的影响 与Con组比较，CA-L组、CA-M组、CA-H组细胞增殖抑制率升高(P<0.05)，细胞克隆形成数减少(P<0.05)，且呈剂量依赖性。见表1。

表1 巴豆生物碱对结直肠癌SW620细胞增殖的影响

2.2 巴豆生物碱对结直肠癌SW620细胞凋亡的影响 与Con组比较，CA-L组、CA-M组、CA-H组细胞凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白水平升高(P<0.05)，且呈剂量依赖性。见图1，表2。

图1 巴豆生物碱对结直肠癌SW620细胞凋亡的影响；A 凋亡相关蛋白表达；B 细胞凋亡流式图

表2 巴豆生物碱对结直肠癌SW620细胞凋亡的影响

2.3 4组细胞miR-4317表达水平比较 与Con组比较，CA-L组、CA-M组、CA-H组miR-4317的表达量升高(P<0.05)，且呈剂量依赖性。见表3。

表3 巴豆生物碱对结直肠癌SW620细胞miR-4317表达的影响

2.4 过表达miR-4317对结直肠癌SW620细胞增殖和凋亡的影响 与miR-NC组比较，miR-4317组细胞增殖抑制率升高(P<0.05)，细胞克隆形成数减少(P<0.05)，细胞凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白水平升高(P<0.05)。见图2，表4。

图2 过表达miR-4317对结直肠癌SW620细胞凋亡的影响；A 凋亡相关蛋白表达；B 细胞凋亡流式图

表4 过表达miR-4317对结直肠癌SW620细胞增殖和凋亡的影响

2.5 干扰miR-4317表达逆转了100 μg/ml巴豆生物碱对结直肠癌SW620细胞增殖和凋亡的作用 与CA+anti-miR-NC组比较，CA+anti-miR-4317组细胞增殖抑制率降低、细胞凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白水平降低(P<0.05)；细胞克隆形成数增多(P<0.05)。见表5，图3。

表5 干扰miR-4317表达逆转了巴豆生物碱对结直肠癌SW620细胞增殖和凋亡的作用

图3 干扰miR-4317表达逆转了巴豆生物碱对结直肠癌SW620细胞凋亡的作用；A 凋亡相关蛋白表达；B 细胞凋亡流式图

3 讨论

部分中药可抑制结直肠癌细胞生长及转移，但其具体作用机制尚未阐明[8]。miRNA在结直肠癌中表达异常，并调节细胞生物学行为从而抑制或促进结直肠癌的发生及发展，还可能作为结直肠癌治疗的潜在靶点[9,10]。

巴豆生物碱可抑制宫颈癌细胞增殖及促进细胞凋亡从而减缓宫颈癌的发展进程[11]。巴豆生物碱可诱导肝癌细胞凋亡并抑制细胞生长[12]。巴豆生物碱可通过下调PCNA和Ki-67蛋白抑制胃癌细胞增殖，可通过上调Bax和Fas蛋白诱导胃癌细胞凋亡[13]。巴豆提取物对肿瘤生长具有明显抑制作用，并可促进细胞凋亡[14]。

本研究结果显示，巴豆生物碱可以浓度依赖性的方式增高结直肠癌细胞增殖抑制率，减少细胞克隆形成数，提示巴豆生物碱可抑制结直肠癌细胞增殖及克隆形成。本研究结果显示，巴豆生物碱可升高结直肠癌细胞凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白水平，且呈剂量依赖性，提示巴豆生物碱可促进结直肠癌细胞凋亡。

临床胃癌标本中的miR-4317显著降低，过表达miR-4317可抑制胃癌细胞增殖并阻断S-G2/M转换[15]。miR-4317在非小细胞肺癌组织和血清中表达下调，miR-4317高表达的非小细胞肺癌患者具有更高的总生存率，上调miR-4317可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭，并阻碍细胞周期[16]。miR-4317在胃癌组织中呈低表达，并可能作为胃癌诊断及判断患者预后的潜在生物学标记物[17,18]。miR-4317在乳腺癌组织和细胞系中的表达降低，其下调与淋巴结转移、TNM分期和不良预后显著相关，过表达miR-4317可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而下调miR-4317则相反[19]。

本研究结果显示，随着巴豆生物碱浓度的升高，结直肠癌细胞中miR-4317的表达量升高，提示巴豆生物碱可能通过促进miR-4317表达而发挥抗结直肠癌作用。本研究结果显示，miR-4317过表达后结直肠癌细胞增殖抑制率升高，细胞克隆形成数减少，细胞凋亡能力增强，而干扰其表达可降低巴豆生物碱对结直肠癌细胞增殖及凋亡的作用。提示巴豆生物碱可通过促进miR-4317表达而调节结直肠癌细胞增殖及凋亡。

综上所述，巴豆生物碱可抑制结直肠癌细胞增殖及克隆形成并可促进结直肠癌细胞凋亡，其作用机制与上调miR-4317的表达有关，miR-4317可能作为巴豆生物碱治疗结直肠癌的潜在作用靶点，还可为进一步揭示巴豆生物碱抗结直肠癌的分子机制奠定实验基础。但关于其具体作用机制尚需进一步探究。