参附注射液对心肌缺血再灌注大鼠血清炎性因子及TLR4、NF-κB的影响

陈 烈，王智超，刘 霖，朱梦莉

临床通过各种治疗手段恢复梗死相关冠状动脉血流后，伴随心肌损害、心电功能障碍进行性加重的现象称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。有研究显示，炎症反应是MIRI中的重要一环，炎症反应的轻重与心肌梗死后细胞坏死的程度有关[1]。核因子κB(NF-κB)作为MIRI炎症介质表达的始动因素，在各种刺激下NF-κB的活化诱导肿瘤坏死因子α(TNF-α)等相关炎性因子表达，通过炎症反应介导MIRI[2]。Toll样受体4(TLR4)作为NF-κB的上游因子，参与了这一过程。目前将TLR4/NF-κB通路作为缺血再灌注损伤的治疗靶点，已引起国内外学者的广泛关注[3]。本研究以参附注射液为干预药物，通过比较各组大鼠血清TNF-α、白细胞介素6(IL-6)、C反应蛋白(CRP)水平及心肌组织NF-κB、TLR4 mRNA及蛋白表达变化，探讨其抗MIRI的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 湖北省疾病预防控制中心实验动物中心提供的60只健康无特定病原体(SPF)级成年雄性SD大鼠，体质量300～350 g，采用随机数字表法分为对照组(10只)、假手术组(10只)、模型组(20只)和参附组(20只)，动物合格证号No.42000600019496，动物设施使用证号No.00184771。

1.2 药物与给药方法 参附注射液由红参、附片提取而成，主要成分为人参皂苷和乌头碱，由华润三九(雅安)药业有限公司提供(批号：Z51020664)。参附组分别于实验前1 d、实验前1 h和实验术后1 h尾静脉给药，共给药3次，参附注射液剂量为10 mg/kg；对照组给予对应等体积生理盐水。

1.3 实验试剂与仪器 全蛋白提取试剂盒KGP2100购自南京凯基生物科技发展有限公司，组织总RNA提取试剂盒购自天根生物试剂有限公司，Reverse Transcription System逆转录试剂盒购自Promega，兔抗大鼠TLR4抗体、NF-κB抗体购自Santa Cruz生物科技公司，余主要试剂购自美国Cell Signaling Technology公司。仪器：QuantStudio 6实时荧光定量PCR仪、EDC-810 PCR仪、JY02S紫外分析仪、Nano-100微量分光光度计、ICV-450电热恒温培养箱、C2500-R-230V微型高速离心机等。

1.4 MIRI模型制备 实验前大鼠禁食12 h，模型制备方法参照相关文献[4]，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，气管插管、呼吸机支持通气，标准Ⅱ导联记录大鼠心电图，于左胸前第4肋间、第5肋间横向剪开皮肤，钝性分离肌肉组织，剪开心包膜，暴露心脏，于冠状动脉左前降支起始部下2～3 mm处进针，结扎冠状动脉左前降支引起心肌缺血，结扎后Ⅱ导联心电图ST段抬高>0.1 mV或T波高耸及心肌颜色变暗红，提示结扎成功。缺血30 min后放松结扎线后以ST段降低1/2以上、心肌颜色变红润提示再灌注成功，再灌注持续时间为60 min。假手术组大鼠除穿针不予结扎外其他处理均相同。

1.5 观察指标

1.5.1 血清指标测定 酶联免疫吸附法(ELISA)测定大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP含量，参照试剂盒说明。

1.5.2 实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测心肌组织TLR4和NF-κB mRNA表达 采用TRIZOL提取样本中总RNA，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。每管取1 μg总RNA溶液，进行逆转录(反转录、预变性、变性、退火和延伸等)。按说明书在ABI7500荧光实时定量仪上进行定量检测。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参。使用7300SDSv2.0软件进行数据处理和分析，计算不同样本中TLR4和NF-κB mRNA表达。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5.3 免疫印迹法(Western Blot)测定心肌组织TLR4、NF-κB蛋白表达 提取样本蛋白样品，配制十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶，通过电泳将蛋白质样品在SDS-PAGE上进行分离。转膜，封闭，一抗孵育，二抗孵育，显色成像。采用Image-Pro Plus(version 4.1)软件分析蛋白条带积分吸光度值(integrated absorbance，IA=A×面积)，以靶蛋白IA值/β-肌动蛋白IA值比值作为TLR4、NF-κB蛋白的表达。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP含量比较 模型组大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP较对照组升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；参附组TNF-α、IL-6、CRP水平较模型组下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

2.2 各组大鼠心肌组织NF-κB、TLR4 mRNA表达比较 模型组心肌组织NF-κB、TLR4 mRNA表达较对照组均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；参附组NF-κB、TLR4 mRNA表达较模型组均下降，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠心肌组织NF-κB、TLR4 mRNA表达比较(±s)

2.3 各组大鼠心肌组织NF-κB、TLR4蛋白表达比较 模型组心肌组织NF-κB、TLR4蛋白表达较对照组均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；参附组NF-κB、TLR4蛋白表达较模型组均下降，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表4、图1。

表4 各组大鼠心肌组织NF-κB、TLR4蛋白表达比较(±s)

图1 各组大鼠心肌组织NF-κB、TLR4蛋白表达条带图

3 讨 论

MIRI已成为阻碍缺血心肌从再灌注疗法中获得最佳疗效的主要难题。相关研究显示，MIRI病理机制相对复杂，炎症反应作为MIRI重要病理机制之一，伴随整个MIRI过程，干预炎症反应，对改善心脏功能具有重要意义[5-6]。机体在心肌缺血再灌注刺激下活化NF-κB因子并诱导表达TNF-α、IL-6等多种炎性因子介导炎症反应，导致心肌损伤，病理表现为心肌细胞被大量炎性细胞浸润，同时再灌注又可加重急性心肌炎症反应程度，进一步加重炎症反应[7]。

NF-κB是由NF-κB基因编码，一类具有多向调节作用的转录调控因子家族，成员包括p50、p52、p65/RelA、RelB及c-Rel，参与炎症反应、细胞钙稳态、细胞分化和增殖、细胞凋亡等多个病理生理过程，在维持机体正常生理功能中发挥着重要的作用，其中以p50与p65两个亚型与心血管系统关系密切。李郁等[8]发现通过调控NF-κB信号通路对心肌的保护作用，证实该信号通路在MIRI发生发展过程中发挥着重要作用。TLR4是人类发现的第一个TLR相关蛋白，作为固有免疫应答的代表性受体之一，广泛存在于心肌细胞膜上，参与多种生理病理过程[9-10]。有研究显示，缺血再灌注损伤时，TLR4为NF-κB的上游因子，通过识别多种内源性配体及细胞外基质的某些成分，活化NF-κB信号通路，NF-κB进入细胞核，调节促炎基因等相关基因的转录，促进TNF-α、IL-6、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素8(IL-8)等多种炎性因子的活化和表达，介导炎症损伤[11-13]。TNF-α作为机体受到有害刺激后最初分泌的重要炎性因子，可启动NF-κB信号通路活化后炎症级联反应，进一步促进多种炎性因子表达，引发炎症风暴，造成炎症损伤，进一步导致心肌细胞凋亡[14-16]。TNF-α、IL-6作为缺血再灌注损伤中的重要炎症介质，其水平高低可反映炎症反应程度，与缺血再灌注的损害程度呈正相关。多项研究显示，应用TLR4拮抗剂可减轻心肌组织NF-κB活化程度，缩小心肌梗死面积，减轻炎症反应，通过调控TLR4表达，可减轻心肌缺血再灌注所致心肌损伤，改善心脏功能[17-18]。

参附注射液是由中药红参、附片提取制备而成，具有回阳救逆之功效。现代药理研究认为，附子含有多种生物碱，能兴奋和激动β受体，释放儿茶酚胺，发挥强心、抗心律失常及抗氧化作用[19]。另一项实验发现，附子多糖具有抗细胞凋亡作用，可能与调控转录因子NF-κB有关[20]；红参多含有人参皂苷，具有抗氧化、抗衰竭、改善心肌缺血等作用。本研究结果显示，参附注射液干预心肌缺血再灌注大鼠，可降低大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP含量，减轻炎症反应，同时参附注射液干预后NF-κB，TLR4 mRNA及蛋白表达水平较模型组均下降。

参附注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤有保护作用，其机制可能与调控TLR4/NF-κB通路、抑制炎症反应有关。