基于TGF-β1/Smad3信号通路探讨参附注射液对缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用

王 礼，段春梅

缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)又称为脑梗死，是一种常见的神经系统疾病，由于脑血管病变组织短暂性供血障碍，引起炎性因子及自由基积累，脑组织缺血、缺氧甚至坏死，最终导致神经细胞异常凋亡、发生梗死[1-2]。IS发病率和死亡率逐年升高，具有病后恢复时间长、预后不理想等特点，给社会和家庭造成沉重负担[3]。转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一种多功能调节肽，参与体内生理、生化反应及信号转导。正常情况下，大脑组织几乎不表达TGF-β1，在缺血条件下TGF-β1表达升高[4]。TGF-β1能促进下游Smad3蛋白磷酸化，激活的Smad3进入细胞核，启动相关转录因子表达，从而参与神经细胞的生长、增殖、分化和凋亡，发挥神经保护作用[5]。Caruso等[6]研究显示，应用TGF-β1对体外培养的神经细胞进行干预，可降低一氧化氮导致的神经毒性。Kotlarz等[7]研究显示，TGF-β1表达缺失可加重病人脑部组织炎性损伤。参附注射液主要成分为人参皂苷、乌头类生物碱，可增加血流灌注量，延长动物耐缺氧时间，具有抗炎、抗内毒素及保护血管内皮细胞等作用[8]。参附注射液对脑缺血性损伤的保护作用已有报道。杜婷等[9]研究显示，参附注射液可清除氧自由基，抑制脂质过氧化反应，从而减轻神经功能损伤，降低脑缺血再灌注损伤。钟升华等[10]研究显示，参附注射液可促进急性脑梗死病人神经功能恢复，降低致残率。参附注射液是否通过TGF-β1/Smad3信号通路在IS中发挥作用研究报道较少。本研究通过改良Longa线栓法构建大鼠永久性中动脉栓塞模型，探讨参附注射液是否通过TGF-β1/Smad3信号通路对IS大鼠发挥神经保护作用，以期为参附注射液治疗IS提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 48只10～12周龄、体质量(250±20)g的无特定病原体(SPF)级SD雄性大鼠购自北京生物制品研究所有限责任公司，生产许可证号：SYXK(京)2020-0031。饲养环境为室温23 ℃，标准湿度60%，12 h/12 h昼夜交替，正常供应饲料和饮用水，分笼饲养。饲养1周后用于实验。

1.1.2 实验试剂和仪器 参附注射液(雅安三九药业有限公司)；TGF-β1蛋白(美国Selleck公司)；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)(美国Sigma公司)；TGF-β1、p-Smad3、B细胞淋巴瘤-2基因(B cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 related X protein，Bax)抗体(美国CST公司)；辣根过氧化物酶标记的二抗(北京博尔西科技有限公司)；原位末端凋亡检测(TUNEL)试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；二喹啉甲酸法(BCA)蛋白测定试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；伊文思蓝(国药集团化学试剂有限公司)；酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；Thermo酶标仪(上海热电仪器有限公司)；超净工作台(苏州净化设备厂)；组织包埋机(德国Leica公司)；脑立体定位仪(美国Corning公司)；台式冰冻离心机(美国Beckman公司)；蛋白电泳仪(美国Bio-Rad公司)；X71光学显微镜(日本Olympus公司)；激光散斑成像仪(瑞典PERIMED公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型构建与分组 将48只大鼠随机分为Sham组、Vehicle组、参附注射液组(40 mg/kg[11])和TGF-β1组(20 mg/kg[12])。采用改良Longa线栓法[13]构建Vehicle组、参附注射液组、TGF-β1组大鼠永久性中动脉栓塞模型：腹腔注射0.3%戊巴比妥钠(3 mL/kg)麻醉，固定于手术台上，消毒后在颈部纵切，剥离其他组织，暴露并游离出右侧3支动脉；自颈总动脉插入颈内动脉，在颈外动脉分叉处结扎并剪断线栓。缝合皮下组织和皮肤。最后对切口皮肤消毒。Sham组只插入线栓不结扎，其余操作同Vehicle组。

建模成功的标准[14]：大鼠左侧肢体疼痛迟钝或消失；倒悬时左上肢不能完全伸展；行走时身体向左侧倾倒或转圈。排除蛛网膜下腔出血和死亡的大鼠。

建模结束2 h后，参附注射液组和TGF-β1组分别腹腔注射对应剂量的参附注射液和TGF-β1，Sham组和Vehicle组腹腔注射等量生理盐水，每日固定时间注射1次，连续给药14 d。

1.2.2 各组大鼠一般状态及神经功能评分 参照Longa神经功能缺损评分方法[15]，动物造模14 d后对神经功能缺损症状进行评分并记录，评分标准：0分为无神经损伤症状；1分为左前肢不能完全伸展；2分为行走时身体转向左侧；3分为行走时身体向左倒下；4分为瘫痪，无法站立。

1.2.3 激光散斑成像观察各组大鼠大脑皮层血流变化 完成神经功能缺损评分后，采用0.3%戊巴比妥钠(3 mL/kg)麻醉大鼠，保持背部固定姿势，从头顶纵切，分离皮肤，剥离顶部骨膜，充分暴露大脑皮质。激光散斑成像仪扫描记录大脑皮质血流彩图，比较大脑皮质血流灌注情况。

1.2.4 伊文思蓝染色测定血脑屏障通透性 完成神经功能缺损程度评分后，尾静脉注射4 mL/kg的2%的伊文思蓝溶液，2 h后麻醉大鼠，使用生理盐水灌注心脏，当脑组织其他部位伊文思蓝冲洗时断头取脑。与50%的三氯乙酸1 mL制成匀浆，4 ℃离心20 min，使用酶标仪620 nm处检测上清液吸光度。同时测定已知浓度梯度伊文思蓝的OD值作为标准曲线，根据标准曲线计算样品伊文思蓝含量，反映血脑屏障通透性。

1.2.5 TTC染色法测定大鼠脑梗死体积 采用0.3%戊巴比妥钠(3 mL/kg)麻醉大鼠后断头取脑，将各组脑组织分为10等份，于-20 ℃冰箱待测，取1份脑组织制成2 mm冠状切片。将切片浸入2%TTC溶液中，于37 ℃孵育15 min，4%多聚甲醛溶液中固定24 h，使用数码相机等距拍照(正常脑组织呈红色，梗死脑组织呈苍白色)。将图像导入电脑并采用Image-pro plus6.0图像软件分析大鼠脑梗死体积。

1.2.6 尼氏染色观察各组大鼠脑组织内神经元损伤 取1份脑组织，常规固定、石蜡包埋，制成5 μm厚的冠状切片，按照尼氏染色试剂盒要求进行脱蜡、水化、切片、染色、脱水、透明、封片，光学显微镜(×400)下选取5个视野，观察大鼠脑组织神经细胞及尼氏小体损伤情况。

1.2.7 TUNEL法检测大鼠脑组织细胞凋亡 取1份脑组织，制作石蜡切片及常规脱蜡、梯度乙醇脱水处理，加入蛋白酶K工作液37 ℃作用30 min，浸入3%过氧化氢-甲醇中室温封闭，加入TUNEL混合液于37 ℃避光反应1 h，分别采用梯度乙醇脱水，二甲苯浸泡。最后中性树胶封片，光学显微镜(×400)下选取5个视野，观察染色结果并拍照。凋亡细胞染色呈棕黄色，细胞凋亡率=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。

1.2.8 ELISA法检测各组大鼠脑组织白细胞介素-1β(interleukin -1β，IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin -6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平 取1份脑组织，加入细胞裂解液匀浆，4 ℃、9 000 r/min离心10 min，取上清液，-20 ℃保存待测。按照ELISA试剂盒说明书检测IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

1.2.9 各组大鼠脑组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量 取1份脑组织，加入细胞裂解液匀浆，4 ℃，9 000 r/min离心10 min，取上清液，-20 ℃保存待测。采用黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性；硫代巴比妥酸显色(TBA)检测MDA含量。

1.2.10 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测TGF-β1、p-Smad3、Bcl-2、Bax蛋白表达水平 取1份脑组织，加入细胞裂解液匀浆进行总蛋白提取，使用BCA蛋白试剂盒测定各组蛋白浓度，蛋白定量变性后进行十二烷基酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，电泳后迅速转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，置入含5%脱脂牛奶TBST溶液中室温封闭2 h，分别加入对应一抗TGF-β1、p-Smad3、Bcl-2、Bax(1∶2 000)4 ℃过夜。TBST洗涤3次后，加入二抗(1∶10000)室温孵育2 h，最后避光下加入二氨基联苯胺法(DAB)显色剂显色，Bio-rad凝胶成像仪记录蛋白灰度并拍照，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为对照，对各组蛋白进行相对定量分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般状态及神经功能评分比较 Sham组大鼠皮毛光亮顺滑、活泼好动、饮食饮水正常、体质量增加；Vehicle组大鼠皮毛暗淡杂乱、活动减少、反应迟钝、经常转圈且四肢不协调、食欲不良；与Vehicle组比较，参附注射液组和TGF-β1组大鼠症状改善，四肢趋于协调，饮食饮水增加，体重较Vehicle组增加。与Sham组比较，Vehicle组大鼠神经功能评分增高(P<0.05)；与Vehicle组比较，参附注射液组和TGF-β1组大鼠神经功能评分下降(P<0.05)，参附注射液组和TGF-β1组大鼠神经功能评分比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见图1。提示参附注射液和TGF-β1能改善大鼠神经功能损伤。

Vehicle组与Sham组比较，＊P<0.05；与Vehicle组比较，#P<0.05。图1 各组大鼠神经功能评分比较

2.2 各组大鼠大脑皮层血流灌注量比较 激光散斑成像结果显示，与Sham组比较，Vehicle组大鼠大脑皮层血流灌注量减少(P<0.05)；与Vehicle组比较，参附注射液组和TGF-β1组大鼠大脑皮层血流灌注量增加(P<0.05)；参附注射液组和TGF-β1组大鼠大脑皮层血流灌注量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见图2。提示参附注射液和TGF-β1能增加大鼠血流灌注。

Vehicle组与Sham组比较，＊P<0.05；与Vehicle组比较，#P<0.05。图2 各组大鼠大脑皮层血流灌注量比较

2.3 各组大鼠血脑屏障通透性比较 伊文思蓝染色结果显示，与Sham组比较，Vehicle组伊文思蓝含量升高；与Vehicle组比较，参附注射液组和TGF-β1组伊文思蓝含量降低(P<0.05)；参附注射液组和TGF-β1组伊文思蓝含量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见图3。提示参附注射液和TGF-β1能降低大鼠血脑屏障通透性，改善脑水肿。

Vehicle组与Sham组比较，＊P<0.05；与Vehicle组比较，#P<0.05。图3 各组大鼠伊文思蓝含量比较

2.4 各组大鼠脑梗死体积比较 TTC染色结果显示，Sham组未见白色梗死区，脑组织染色为均一的红色；Vehicle组可见大面积白色梗死区；与Vehicle组比较，参附注射液组和TGF-β1组梗死体积减小，差异有统计学意义(P<0.05)；参附注射液组和TGF-β1组梗死体积比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见图4。提示参附注射液和TGF-β1能减小大鼠梗死体积。

Vehicle组与Sham组比较，＊P<0.05；与Vehicle组比较，#P<0.05。图4 各组大鼠脑梗死体积比较(A为TTC染色图；B为各组梗死体积比较的柱状图)

2.5 各组大鼠脑组织神经元尼氏小体损伤比较 尼氏染色结果显示，Sham组大鼠神经元结构完整，胞体及突起正常，尼氏小体数量丰富，染成深蓝色，胞核结构完整，染成淡蓝色；Vehicle组大鼠神经元数量减少，且排列不规则，胞体皱缩，胞浆呈中空泡样变性，尼氏小体数量减少，染成淡蓝色；参附注射液组和TGF-β1组大鼠神经元结构趋于完整，且数量增加，尼氏小体数量增多，染色较深。详见图5。提示参附注射液和TGF-β1能缓解神经元损伤。

2.6 各组大鼠脑组织神经细胞凋亡比较 TUNEL染色结果显示，与Sham组比较，Vehicle组脑组织神经细胞凋亡增加；与Vehicle组比较，参附注射液组和TGF-β1组大鼠脑组织神经细胞凋亡减少(P<0.05)；参附注射液组和TGF-β1组神经细胞凋亡比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见图6。提示参附注射液和TGF-β1能减少大鼠神经细胞凋亡。

图5 各组大鼠脑组织神经元尼氏小体损伤(×400)

Vehicle组与Sham组比较，＊P<0.05；与Vehicle组比较，#P<0.05。图6 各组大鼠神经细胞凋亡比较(×400)(A为TUNEL染色图；B为各组神经细胞凋亡率比较的柱状图)

2.7 各组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β和IL-6含量比较 ELISA结果显示，与Sham组比较，Vehicle组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β和IL-6含量升高(P<0.05)；与Vehicle组比较，参附注射液组和TGF-β1组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β和IL-6含量下降，差异有统计学意义(P<0.05)；参附注射液组和TGF-β1组TNF-α、IL-1β和IL-6含量比较，差异无统计意义(P>0.05)。详见图7。提示参附注射液和TGF-β1能减轻大鼠炎症反应。

Vehicle组与Sham组比较，＊P<0.05；与Vehicle组比较，#P<0.05。图7 各组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β和IL-6含量比较

2.8 各组大鼠脑组织SOD、MDA含量比较 检测结果显示，与Sham组比较，Vehicle组大鼠脑组织SOD水平下降，MDA水平升高(P<0.05)；与Vehicle组比较，参附注射液组和TGF-β1组大鼠脑组织SOD水平升高，MDA水平下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；参附注射液组和TGF-β1组SOD、MDA水平比较，差异无统计意义(P>0.05)。详见图8。提示参附注射液和TGF-β1能减轻大鼠氧化应激损伤。

Vehicle组与Sham组比较，＊P<0.05；与Vehicle组比较，#P<0.05。图8 各组大鼠脑组织SOD、MDA含量比较(A为SOD表达柱状图；B为MDA表达柱状图)

2.9 各组大鼠脑组织TGF-β1、p-Smad3、Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较 Western Blot结果显示，与Sham组比较，Vehicle组大鼠脑组织TGF-β1、p-Smad3、Bax蛋白表达量升高，Bcl-2蛋白表达量下降(P<0.05)；与Vehicle组比较，参附注射液组和TGF-β1组大鼠脑组织Bax蛋白表达量降低，TGF-β1、p-Smad3、Bcl-2蛋白表达量升高(P<0.05)；参附注射液组和TGF-β1组各蛋白表达比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见图9。提示参附注射液和TGF-β1影响TGF-β1/Smad3信号通路，增加Bcl-2/Bax比值。

Vehicle组与Sham组比较，＊P<0.05；与Vehicle组比较，#P<0.05。图9 各组大鼠脑组织TGF-β1、p-Smad3、Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较(A为TGF-β1、p-Smad3蛋白表达条带图；B为TGF-β1、p-Smad3蛋白表达柱状图；C为Bcl-2、Bax蛋白表达条带图；D为Bcl-2、Bax蛋白表达柱状图)

3 讨 论

IS是由于脑供血不足引起脑组织局部软化坏死的脑血管病，多发于老年人群，临床表现为头晕头痛、肢体偏瘫等，甚至导致脑疝、昏迷，严重威胁病人生命健康。有研究表明，脑梗死的发病机制与神经细胞能量代谢失衡、炎性因子异常表达、酸性物质毒性作用及神经细胞凋亡有关[16]。现代药理学研究表明，参附注射液可有效清除氧自由基和过氧化物，抑制炎症细胞浸润，保护血管内皮细胞，用于防护心脑血管疾病[17]。王丽娟[18]研究显示，参附注射液佐治老年脑梗死效果显著，通过抑制机体C反应蛋白、IL-6等炎性因子水平，减轻炎症反应。因此，本研究从行为学、形态学和生物化学等方面验证参附注射液对大鼠IS具有保护作用。

本研究结果显示，Vehicle组大鼠较Sham组皮毛暗淡杂乱、活动减少、反应迟钝、经常转圈且四肢不协调、食欲不良，表现出神经功能缺失症状；参附注射液和TGF-β1干预后，大鼠神经缺失症状明显改善，四肢趋于协调、饮食饮水增加、体重较Vehicle组明显增加。表明参附注射液和TGF-β1能改善大鼠神经功能障碍。本研究结果还显示，参附注射液组和TGF-β1组大鼠大脑皮层血流灌注量较Vehicle组增加，脑梗死体积、细胞凋亡及损伤减少，血脑屏障恢复。提示参附注射液和TGF-β1在IS中发挥着重要的保护作用。

TGF-β1在神经细胞生长、分化和凋亡等过程中发挥着重要作用。正常生理情况下，TGF-β1表达量较少，在缺血缺氧环境中表达上调，异常表达的TGF-β1通过激活下游p-Smad3，将Smad3转移至细胞核，启动相应基因表达，从而促进脑血管生成，保护神经，抵抗凋亡[19]。脑室注射TGF-β1可明显减轻脑缺血海马CA1区锥体神经元损害[20]。相关研究表明，TGF-β1/Smad3信号通路能抑制IS大鼠脑组织细胞凋亡[21]。本研究中Vehicle组较Sham组TGF-β1、Smad3蛋白表达增加，说明缺血缺氧环境刺激其表达，参附注射液和TGF-β1干预后，TGF-β1、Smad3表达较Vehicle组增加，TGF-β1作为对照药物，与参附注射液干预结果比较，差异无统计学意义，推断参附注射液对IS的保护作用可能是通过激活TGF-β1/Smad3信号通路，增加TGF-β1、Smad3表达实现的。

MDA是氧自由基引起的过氧化代谢产物，与细胞损伤程度呈正相关。SOD是抗氧化物酶，可中和活性氧，阻断脂质过氧化反应，反映机体清除氧自由基能力。有研究表明，大鼠脑缺血再灌注后可产生大量氧自由基，MDA含量升高，SOD活性下降[22]。本研究中Vehicle组大鼠MDA含量提高，SOD活性下降，经参附注射液和TGF-β1干预后，MDA含量下降，SOD活性提高，说明参附注射液和TGF-β1可减轻IS大鼠氧化应激损伤。IS引起一定程度的炎症反应，进而造成脑组织炎症损伤。TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子直接参与机体炎症反应，可评估病人病情。肖东芳等[23]研究发现，血清TNF-α、IL-6水平与IS病情严重程度呈正相关，梗死面积越大，TNF-α、IL-6水平越高。本研究中Vehicle组大鼠TNF-α、IL-6水平升高，经过参附注射液和TGF-β1干预后，TNF-α、IL-6水平降低，提示参附注射液和TGF-β1能减轻IS大鼠炎症反应。

脑缺血损伤后，缺血程度较重时表现为神经元坏死，较轻时表现为细胞凋亡。若能恢复缺血区供血，可抑制细胞凋亡。Bax是促凋亡蛋白，Bax同源二聚体的形成诱导凋亡。Bcl-2是抗凋亡蛋白，通过控制线粒体外膜的通透性阻止凋亡信号转导，Bcl-2和Bax异源二聚体的形成可抑制凋亡。龙艳芳等[24]研究显示，在中动脉栓塞模型大鼠中，Bcl-2/Bax比值越大，细胞存活率越高，Bcl-2/Bax比值越小，细胞凋亡率越高。于腊梅等[25]研究显示，大脑缺血组大鼠Bax表达增加，Bcl-2表达减少，参附注射液治疗组Bax表达减少，Bcl-2表达增加。本研究中Vehicle组大鼠较Sham组Bax表达增加，Bcl-2表达减少，经参附注射液和TGF-β1干预后，Bax表达减少，Bcl-2表达增加，提示参附注射液和TGF-β1能调控Bcl-2/Bax比值抑制IS大鼠细胞凋亡。

综上所述，参附注射液可改善脑缺血大鼠血流灌注，缩小脑梗死体积，抑制机体氧化应激、炎症反应及细胞凋亡，可能通过激活TGF-β1/Smad3信号通路发挥对IS大鼠神经细胞的保护作用。但参附注射液是否通过其他信号通路发挥作用及参附注射液治疗的最佳剂量，仍需进一步研究。