液相色谱法测定乳粉中唾液酸含量的不确定度评定

钱振杰，陈敬，游淑珠，赵悦，何咏欣，冯家望

（1. 广州市食品检验所，广州 511400； 2. 拱北海关技术中心，广东珠海 519000）

唾液酸是以9个碳为母链的α-酮酸[1]，在生物体中主要以唾液酸衍生物的形式存在[2-3]，目前发现类型已超过50 种。唾液酸在哺乳动物的脑、乳、血液和神经阻滞黏蛋白中含量较高，其中N-乙酰神经氨酸在乳中所占质量比例可达96%。唾液酸积极参与动物体内蛋白水解保护、细胞识别、生殖、感染、免疫和认知发育等生物学作用[4]。在婴幼儿成长发育中，唾液酸可通过提高大脑神经细胞的信息传递速度，促进婴儿的记忆力和智力发育，还可以提高儿童肠道吸收能力及免疫力[5-7]，因此婴幼儿配方乳粉生产厂家常将唾液酸含量标示于产品外包装上，以此作为宣传要点，而监管部门对唾液酸的含量标识监管就显得非常重要。

在化学分析过程中，由于误差的存在，测量结果往往与实际值存在一定偏离，引入不确定度评定对测量结果的准确性有帮助。目前，测定乳制品中唾液酸含量的方法主要有光度法[8-9]、酶化学法[10-11]、离子色谱法[12-13]、液相色谱法[14-17]及质谱法[18-20]等，国内外暂无相关检测标准发布。笔者采用液相色谱方法对乳粉中唾液酸的含量进行测定[21]，依据CNASGL006：2019《化学分析中不确定度的评估指南》[22]、JJF 1059.1—2012《测量不确定度评价与表示》[23]的要求，识别测量过程中的不确定度分量，并进行分析和计算，为评估检测结果的质量水平、改善实验操作提供理论依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱仪：e2695 型，配2475 荧光检测器，美国沃特世公司。

分析天平：CPA 225D 型，感量为0.1 mg、0.001 mg，德国赛多利斯集团。

移 液 器：100 μL，1 000 μL，德 国Eppendorf公司。

N-乙酰神经氨酸标准品：质量分数大于98%，美国Supelco公司。

乙腈、四氢呋喃：色谱纯，美国Sigma公司。

磷酸、硫酸、氢氧化钠、邻苯二胺：分析纯，上海安谱公司。

1.2 仪器工作条件

色谱柱：SB-AQ C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司)；柱温：30 ℃；荧光检测器：λex=231 nm，λem=465 nm；流动相流量：1.0 mL/min；进样体积：10 μL；流动相：A相为乙腈，B相为1%四氢呋喃水溶液(含0.2%的磷酸)；梯度洗脱程序：0～5.0 min，92% (体积分数，下同)B，5.0～10.0 min，92% B～70% B；10.0～12.0 min，70% B；12.0～12.1 min，70% B～92% B；12.1～18.0 min，92%B。

1.3 样品处理

称取约0.2～0.3 g (精确至0.001 g)样品，置于25 mL比色管中，加入20.0 mL硫酸溶液(0.1 mol/L)，充分振荡摇匀，置于80 ℃下水浴2 h，冷却，加入0.625 mL氢氧化钠溶液(6.0 mol/L)调节溶液酸度至近中性，以水定容，摇匀后静置3 h，直至上层澄清。吸取上层清液1.00 mL，置于15 mL 离心管中，再加入1.0 mL邻苯二胺衍生剂(使用0.1 mol/L硫酸氢钠配制)，摇匀后置于80 ℃水浴中衍生50 min，反应结束后用流水冷却，用0.2 μm 一次性针头式滤头过滤，装瓶待测。

1.4 标准溶液配制

唾液酸标准储备液：1 000 μg/mL，准确称取N-乙酰神经氨酸标准品51.02 mg，以水溶解，定容至50 mL。

唾液酸系列标准工作溶液：准确吸取一定体积的唾液酸标准储备液于比色管中，定容至10 mL，配制成质量浓度分别为1.0、5.0、10、20、40 μg/mL的唾液酸系列标准工作溶液。分别吸取1.00 mL唾液酸系列标准工作溶液于15 mL 离心管中，按样品衍生步骤处理，冷却过滤，装瓶待测。

笔者和教研室的教师曾指导过一些考研学生，要求学生锻炼文献收集、整理和分析能力，要求学生攻坚课堂教学中较少涉及的新方法，要求进行程序代码编程设计，要求规范论文写作，并鼓励学生及时将毕业论文研究成果整理成期刊论文进行发表。这些做法收到良好的效果，毕业学生普遍反映非常受益于毕业论文中的研究型题目，普遍反映研究生入学后能够很快融入导师科研团队进行研究，并能够轻松熟练地撰写研究论文。

1.5 建立数学模型

液相色谱法测定乳粉中唾液酸含量按式(1)计算：

式中：X——乳粉样品中唾液酸的质量分数，mg/kg；

ρ——由标准工作曲线中查得的唾液酸质量浓度，μg/mL；

V——乳粉样品溶液定容体积（通常V=25.0 mL），mL；

m——所取乳粉样品的质量，g。

2 结果与讨论

2.1 不确定度来源

根据对1.5数学模型的分析，该方法测量不确定度来源于：(1)标准储备液配制过程引入的相对标准不确定度urel(ρ1)；(2)标准工作溶液配制过程引入的相对标准不确定度urel(ρ2)；(3)标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(ρ3)；(4)样品溶液定容过程引入的相对标准不确定度urel(V)；(5)样品称量过程引入的相对标准不确定度urel(m)；(6)测量重复性引入的相对标准不确定度urel(R)。

2.2 标准储备液配制引入的相对标准不确定度urel(ρ1)

2.2.1 标准物质纯度引入的相对标准不确定度urel(P)

2.2.2 标准物质质量引入的相对标准不确定度urel(ms)

2.2.3 标准储备液定容体积引入的相对标准不确定度urel(Vs)

通过对容量瓶的重复试验，可以估算定容变动产生的不确定度，对典型50 mL容量瓶定容10次称量，得标准偏差为0.02 mL，该值可视为标准不确定度，则重复性引入的相对标准不确定度：

2.3 系列标准工作溶液配制引入的相对标准不确定度urel(ρ2)

依据JJG 10—2005《专用玻璃量器》规定，10 mL 比色管的容积允差为±0.1 mL，由比色管误差引入的相对标准不确定度：

依次类推，可计算5.0、10、20、40 μg/mL 唾液酸标准工作溶液配制过程引入的不确定度，结果列于表1。由表1可知，配制唾液酸系列标准工作溶液引入的相对标准不确定度urel(ρ2)=0.029 24。

表1 唾液酸系列标准工作溶液配制引入的相对标准不确定度

2.4 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(ρ3)

采用上述5种浓度唾液酸标准工作溶液分别上机测定3 次，唾液酸标准工作溶液质量浓度ρi、色谱峰面积Ai及标准曲线线性方程见表2。

表2 唾液酸标准工作溶液的质量浓度、色谱峰面积、线性方程及判别系数

根据贝塞尔公式，标准曲线的标准偏差按式(2)计算：

式中：sR——拟合标准曲线的标准偏差；A

i——各标准点的色谱峰面积；

b——标准曲线的斜率，b=4 951.4；

ρi——各标准点的质量浓度，μg/mL；

a——拟合标准曲线的截距，a=-1 842.9；

n——标准曲线总校准点数，n=15。

将表2数据代入式(2)，计算得sR≈1 634。

实验中对乳粉提取液进行6 次测定，由拟合方程得到唾液酸含量为25.86 μg/mL，则按最小二乘法拟合标准工作溶液校准曲线的不确定度按式(3)计算：

2.5 样品溶液定容体积引入的相对标准不确定度urel(V)

2.6 乳粉样品称量引入的相对标准不确定度urel(m)

实验中称取0.250 g(精确到0.001 g)试样，使用编号为XQJS09042的分析天平，查阅其检定证书可知扩展不确定度U=0.3 mg，k=2，故：

2.7 测量重复性引入的相对标准不确定度urel(R)

乳粉中唾液酸含量测定前处理需经过酸水解、调节pH值、定容、移取、衍生、过滤等步骤，每步操作都不可避免地引入不确定度分量，分别评估每一步骤对测量结果不确定度的影响难度较大，故按照1.3方法对同一样品重复测定6 次，采用统计分析的方法对重复性引入的不确定度进行评估，结果见表3。

表3 乳粉中唾液酸含量测定重复性试验结果

2.8 不确定度合成与结果表示

乳粉样品溶液的浓度、定容体积、称取质量和测量重复性等不确定度数据见表4。以上不确定度分量相互独立，将其合成得测定结果的相对标准不确定度：

表4 乳粉中唾液酸含量相对测量不确定度

取包含因子k=2 (置信概率为95%)，则测量结果的扩展不确定度U(X)=2urel(X)=0.059 18，唾液酸的含量测定结果可表示为(2 586±153)mg/kg。

3 结语

通过对液相色谱法测定乳粉中唾液酸含量的不确定度评定发现：造成唾液酸测定结果不确定度偏高的主要因素有标准工作溶液配制、样品定容以及测量重复性等三个方面。为了降低对以上三个相对测量不确定度分量的影响，保证测量结果的科学性与准确性，应该对今后的实验过程进行优化与改进。首先，尽量使用适合精度的工具配制浓度范围满足乳粉中唾液酸测定实测值的系列标准溶液，避免因标准工作溶液量取及稀释对测定结果造成较大的影响；其次，在日常检验过程中对样品进行合理稀释，避免大体积或多次稀释；最后，加强实验人员的操作规范性培训，增加平行样品的测定次数等措施降低A类不确定度。