氯吡脲纯度标准物质研制

陈文文，杨梦瑞，王敏，刘权辉，周剑，王彤彤

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全重点实验室，北京 100081）

氯吡脲又称1-(2-氯-4-吡啶)-3-苯基脲，是一种新型高效植物生长调节剂，其细胞分裂活性是苄氨基嘌呤的10倍、4-吡啶脲的100倍，其主要作用是促进细胞分裂、扩大细胞体积，促进器官形成和蛋白质合成，在提高坐果率、增加产量方面有非常显著的效果[1-4]。作为一种植物生长调节剂，氯吡脲在国内外的应用越来越广泛，在我国属于登记限量使用的农药品种，目前已在黄瓜、猕猴桃、西瓜、甜瓜、葡萄、脐橙和枇杷等果蔬上登记使用[5]。我国对不同水果蔬菜中的氯吡脲规定了最大残留限量，但是仍有不少果蔬种植户违规过量使用氯吡脲，使得果蔬中氯吡脲含量超标，对人体健康造成潜在风险[6-7]。农产品中氯吡脲检测方法报道较多，但是保证测量数据可靠、可比、可溯源的标准物质较少，尤其作为量值溯源基础的国家一级标准物质尚未见报道。研制氯吡脲纯度一级标准物质，对于保证检测数据的量值溯源与准确可靠非常有必要。

纯度标准物质具有准确性、均匀性、稳定性等主要特征，纯度测量过程也是给标准物质定值的过程[8]，因此可以通过连续的溯源链，使测量结果直接与国际基本单位(SI 单位)联系而具有可比性[9]。目前，标准物质的定值方法主要有质量平衡法、滴定法、示差量热扫描法、定量核磁法等[10-11]。质量平衡法也叫杂质扣除法，是一种间接定值方法[12]。利用高效液相色谱仪、卡尔费休滴定仪、顶空气相色谱仪、电感耦合等离子体质谱仪等多种仪器进行测定，可消除水分、挥发性有机杂质以及无机杂质对主成分含量测定结果的影响[13]，提高对主成分纯度定值的准确度[14]。杨嘉伟等[15]采用质量平衡法对异辛烷纯度标准物质开展纯度定值研究工作，纯度(质量分数)为99.86%。黄彦捷等[16]采用质量平衡法对碱性橙Ⅱ进行了纯度分析，结果表明，该标准物质的纯度(质量分数)认证值为99.2%，已被认定为国家二级标准物质。近年来，核磁定量技术也被广泛应用于在纯度标准物质定值方面，作为一种直接定值方法，在分析混合物时，可以采用其各个组分的各自指定基团上质子产生的吸收峰强度进行相对比较，然后求得相对含量，该方法快捷、简便，可利用有证标准物质作为内标，将测量结果直接溯源至SI 单位[14]。李雪娇等[17]采用核磁共振氢谱建立了一种徐长卿中丹皮酚含量的快速、准确、精密的检测方法。

笔者选择高纯度纯品原料，采用质量平衡法与定量核磁技术两种不同原理的方法对氯吡脲纯度标准物质定值，考察了氯吡脲纯度标准物质均匀性、稳定性，并评估了标准物质量值的不确定度。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

微量水分测定仪：DL32 型，瑞士梅特勒-托利多公司。

分析天平：XS105 型，瑞士梅特勒-托利多公司。

气相色谱仪：7890 A 型，配氢火焰离子化检测器，美国安捷伦科技有限公司。

电感耦合等离子体质谱仪：Agilent 7500a型，美国安捷伦科技有限公司。

核磁共振仪：Bruker AVANCE Ⅲ型，德国布鲁克公司。

电子天平：UMX2 型，瑞士梅特勒-托利多公司。

氯吡脲：纯度(质量分数)为大于100.3%(非水滴定法)，上海梯希爱化成工业发展有限公司。

肌酐标准物质：美国标准物质编号为NIST914a，质量分数为(99.7±0.3)%，美国国家标准与技术研究院。

氘代乙酸：质量分数99.5%，北京百灵威科技有限公司。

氘代二甲基亚砜：质量分数99.8%，北京百灵威科技有限公司。

其它有机溶剂：色谱纯，德国默克公司。

1.2 实验步骤

1.2.1 原材料选择

选择高纯品氯吡脲作为标准物质候选物，经过红外光谱法、高分辨质谱法以及核磁定性分析后分装于4 mL 棕色玻璃瓶中，每瓶为100 mg，共200 个包装单元，作为纯度标准物质样品，置于-20 ℃冷冻避光保存。

1.2.2 定值

参照“国家一级标准物质技术规范”，通过前期文献调研及预实验结果，采用高效液相色谱质量平衡法和定量核磁法两种不同原理的方法对氯吡脲纯度标准物质定值。为保证测量结果的溯源性与准确性，使用的仪器设备经过计量检定或标准物质校准。

(1)质量平衡法[9]。高效液相色谱仪：岛津LC-20A 系统；色谱柱：Agilent Plus C18柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)；流动相：水-乙腈(体积比为55∶45)，流量为1.0 mL/min；进样体积：10 μL；分析波长：260 nm。利用色谱峰面积归一化法对氯吡脲进行定量。

卡尔费休法测定水分含量：利用水分标准物质校准仪器后，称取10 mg 样品，待滴定结束，记录水分含量。模拟加样过程、质量及时间，不加样进行测定，计算空气中的水分空白值，扣除空白后得到最终结果。

(2)核磁共振定量法。采用氢谱核磁共振技术，选择肌酐作内标物，氘代二甲基亚砜作为定值的氘代溶剂。参照文献[18]计算氯吡脲的纯度。

1.2.3 均匀性检验

随机抽取15个包装单元，每个单元取3个子样，称样量为3 mg，配制成质量浓度为1 000 mg/L的甲醇溶液，采用质量平衡法优化的高效液相色谱方法对主成分纯度进行均匀性检验。测定结果扣除水分含量，挥发性杂质以及无机元素的含量，采用单因素方差分析法和F检验进行分析。

1.2.4 稳定性考察

长期稳定性：在分装储藏后的0、1、3、6、12个月抽样测定。每次抽取2个单元，采用质量平衡法，每个单元取样3次配制成1 000 mg/L的溶液。以每次测得的液相色谱峰面积归一化结果扣除随时间测定的水分含量的平均值(n=6)，以及定值实验时测定的挥发性杂质和无机元素含量平均值作为长期稳定性检验结果进行统计分析。

短期稳定性：模拟运输过程温度变化，将样品置于20 ℃和60 ℃恒温箱中保存，分别在第0、1、3、5、7天进行稳定性监测。测定方法与长期稳定性监测相同。

2 结果与讨论

2.1 原料核验结果与标准物质定值

根据JJF 1343 等标准物质技术规范要求，采用质量平衡法与定量核磁法两种不同原理的方法对氯吡脲纯度标准物质样品进行纯度核验，对主成分与有机杂质含量进行高效液相色谱法分析。

采用高效液相色谱法-二极管阵列(DAD)检测器，对待分析的氯吡脲样品进行了光谱扫描，以确定其可能的最大吸收波长。基于文献报道，采用水和乙腈作为流动相，并比较了不同色谱柱、不同流动相比例对于杂质及其主成分分离效果的影响。结果表明，Agilent Plus C18色谱柱能够实现杂质与主成分的基线分离。在此基础上，改变水-乙腈体积比为55∶45，结果发现杂质均能洗脱出来，且主成分以及杂质之间达到较好的分离效果，满足分析要求。图1为该色谱条件下氯吡脲的高效液相色谱图。

图1 氯吡脲高效液相色谱图

采用卡尔费休水分滴定法测定了氯吡脲纯度标准物质含水量约为0.153%。同时，分别采用顶空气相色谱法和ICP-MS法分析了有机挥发性杂质和无机非挥发性杂质，结果均小于0.1%。根据质量平衡法，氯吡脲质量平衡法纯度定值结果为99.44%，见表1。

表1 氯吡脲质量分数的质量平衡法定值结果 %

根据标准物质技术规范要求，同一家实验室应采用不少于两种的不同原理定值方法定值。首先考察了氘代溶剂，氘代溶剂的选择要求氯吡脲和内标同时在该氘代溶剂中具有良好的溶解度，且相互之间不发生化学反应。通过溶解度测试实验发现，氘代二甲基亚砜能够同时溶解氯吡脲和常见的内标物肌酐、苯甲酸，因此选择氘代二甲基亚砜作为定值的氘代溶剂。其次，重点考察了两种内标。针对定量核磁的内标要求：一是有证标准物质，能够进行量值传递；二是不与被测物发生反应；三是用于定量的核磁峰相互之前不重叠。图2为苯甲酸、肌酐、肌酐与氯吡脲混合样品的1H-NMR 谱图。由图2 可以看出，苯甲酸的氢峰与氯吡脲氢峰重合，不适用于定量，而肌酐化学位移3.67×10-6处氢峰与氯吡脲7.05×10-6处氢峰无相互干扰，峰形尖锐，满足定量要求。

图21H-NMR谱图

对随机抽取的7瓶氯吡脲标准物质进行平行测定，结果见表2。由定量核磁法测定的氯吡脲纯度标准物质的质量分数为99.51%。

表2 氯吡脲纯度标准物质质量分数核磁测量结果 %

对两种方法所得两组结果采用F检验进行等精度检验，得：

经查临界值F0.95(6，6)=4.28，1/F0.95(6，6)＜F＜F0.95(6，6)，表明两组数据等精度。

对两组结果采用t检验进行结果一致性检验：

式中：P——氯吡脲纯度标准物质定值结果，%；

PMB——氯吡脲纯度标准物质质量平衡法定值结果，%；

PqNMR——氯吡脲纯度标准物质定量核磁法测量结果，%。

综上所述，氯吡脲纯度标准物质定值结果为99.5%。

2.2 均匀性检验

均匀性检验采用高效液相色谱峰面积归一化法，按照整个封装过程的前、中、后时间阶段，从已分装的氯吡脲标准物质中随机抽取15 个包装单位进行均匀性检，每个单元配制三个子样，称样质量为3 mg，分别配制成质量浓度为1 000 mg/L 的甲醇溶液，对随机抽取的样品编号为1#～15#。图3 为氯吡脲纯度标准物质均匀性检验结果。采用单因素方差分析法(ANOVA)和F检验对测量结果进行均匀性检验，由数据计算得：组间方差s12=0.000 355 8，组内方差s22=0.000 186 1，F=s12s12=1.91，查表得临界值F0.05(14，30)=2.04，F＜F0.05(14，30)，表明该标准样品均匀性良好，符合技术规范要求。

图3 氯吡脲纯度标准物质均匀性检验结果

2.3 稳定性考察

按照JJF 1343—2012《标准物质的通用原则及统计学原理》稳定性评估的方案可以为经典稳定性评估和同步稳定性评估，所研制的标准物质中长期稳定性评估采用的是经典稳定性评估方案，短期稳定性评估采用的是同步稳定性评估方案。根据JJG 1006—1994《一级标准物质技术规范》中的要求，标准物质稳定性考察按照先密后疏的原则，从2020年3 月到2021 年3 月，分别在第0、1、3、6、12 个月进行了稳定性考察。采用重量-容量法配制溶液，每次抽取2 个单元，以每次测得的液相色谱峰面积归一化结果扣除随时间测定的水分含量的平均值(n=6)，以及定值实验时测定的挥发性杂质和无机元素含量平均值作为长期稳定性检验结果进行统计分析。图4为氯吡脲纯度标准物质长期稳定性监测结果。以监测时间和测定结果拟合直线，采用趋势分析法[17]进行稳定性检验，说明12个月内氯吡脲纯度及其包装单元内的水分含量没有明显的变化趋势，稳定性检验合格。

图4 氯吡脲纯度标准物质长期稳定性监测结果

将样品置于20 ℃和60 ℃恒温箱中(模拟运输条件)保存，分别在第0、1、3、5、7 天进行稳定性监测，测定方法与长期稳定性监测相同。以每次测得的液相色谱面积归一化结果扣除定值实验时测定的水分、挥发性杂质和无机元素含量平均值作为长期稳定性检验结果进行统计分析，采用趋势分析对监测数据进行考察。图5为氯吡脲纯度标准物质短期稳定性监测结果。由图5可见，该标准物质在60 ℃及以下的运输条件下7天内可保证纯度量值稳定。

图5 氯吡脲纯度标准物质短期稳定性监测结果

综上所述，氯吡脲纯度标准物质12个月长期稳定性良好，虽然60 ℃模拟运输温度、7 天的运输时间条件下特性量值通过了稳定性检验，但是从数据分析，量值存在波动，因此该标准物质应采取干冰或冰袋运输，运输温度控制在20 ℃以下。

2.4 不确定度评定

氯吡脲纯度标准物质的不确定度由三部分组成：标准物质的均匀性引入的不确定度、标准物质的稳定性引入的不确定度(短期稳定性和长期稳定性)以及标准物质定值过程引入的不确定度(质量平衡法和定量核磁法)。基于前期研究报道的不确定度评估与计算方法[19]，系统分析与评估了氯吡脲纯度标准物质研制过程中的不确定度，评估结果见表3。氯吡脲纯度标准物质纯度值(质量分数)为99.5%，扩展不确定度为0.4%(k=2)。

表3 氯吡脲纯度标准物质不确定度评定结果

3 结语

研究结果表明，两种不同原理定值方法准确可靠，结果一致性良好；氯吡脲纯度标准物质的纯度(质量分数)定值结果为99.5%，扩展不确定度为0.4% (k=2)；量值均匀性良好、稳定性可靠，符合国家一级标准物质技术规范的要求，并获得国家一级标准物质编号GBW 09290。氯吡脲纯度标准物质的成功研制，为相关基体标准物质研制建立起完整的SI单位计量溯源链，保证了氯吡脲相关检测结果的计量溯源性。