气相色谱–质谱法测定速溶咖啡中糠醛和5-羟甲基糠醛

王建国，常虹，王芳，雷凯，籍术良，张国峰，王艳春

（1. 北京市通州区疾病预防控制中心，北京 101100； 2. 北京市通州区妇幼保健院，北京 101101）

糠醛、5-羟甲基糠醛是两种在食品热加工过程中产生的糠醛化合物，属于内源性污染物。高浓度下5-羟甲基糠醛对人体黏膜、横纹肌和内脏均具有刺激和损伤作用，具有基因毒性和遗传毒性[1-2]。咖啡具有提神醒脑、消除疲劳、生津止渴、利尿等功效[3]，逐渐成为人们不可缺少的日常饮品。速溶咖啡是咖啡的一种，是采用物理方法，以水为唯一载体从焙炒咖啡粉中提取的干的水溶性产品[4]，由于在居家旅行中食用方便、物美价廉，为消费者喜爱，产销量逐年增加[5]。糠醛、5-羟甲基糠醛广泛存在于咖啡中[6]，5-羟甲基糠醛为美拉德反应的中间产物，在咖啡中含量较高，有研究发现5-羟甲基糠醛咖啡中最高含量达到13.5 g/kg[7]。目前食品中糠醛、5-羟甲基糠醛的测定方法主要有气相色谱法[8]、比色法[9]、液相色谱法[10-12]气相色谱-串联质谱法[13-14]、液相色谱-串联质谱法[15-16]，但文献中鲜有速溶咖啡中糠醛、5-羟甲基糠醛的报道。笔者按照QuEChERS 原则对样品进行净化，以同位素内标法进行定量，建立了灵敏度高、准确性好的气相色谱-质谱(GC-MS)法，满足速溶咖啡中糠醛、5-羟甲基糠醛检测的需求。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱-质谱联用仪：7890A/7000B型，美国安捷伦科技公司。

涡旋混合器：Vortex-2型，德国艾卡公司。

高速台式冷冻离心机：5810R 型，德国艾本德公司。

糠醛、5-羟甲基糠醛、糠醛-d4、5-羟甲基糠醛-13C6溶液：质量浓度均为100 μg/mL，天津阿尔塔科技有限公司。

乙腈、丙酮、正己烷、乙酸乙酯：色谱纯，美国费希尔公司。

净化管：(1)AN50E011 型(内置100 mg C18、50 mg 强阳离子交换剂及150 mg 无水MgSO4)，北京纳鸥科技有限公司；(2)5982-5021 型(内置25 mgN-丙基乙二胺、150 mg MgSO4)，5982-5321 型(内置25 mgN-丙基乙二胺、7.5 mg 石墨化碳黑及150 mg MgSO4)，美国安捷伦科技有限公司。

速溶咖啡样品：市售。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱仪

色谱柱：HP-INNOWAX 毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美国安捷伦科技有限公司)；柱温：程序升温，初始温度为65 ℃，保持2 min，然后以20 ℃/min 升至165 ℃，再以30 ℃/min 升至240 ℃，保持3 min；进样口温度：230 ℃；进样体积：1 μL；进样方式：不分流；柱流量：1.00 mL/min。

1.2.2 质谱仪

离子源温度：240 ℃；色谱-质谱接口温度：240 ℃；溶剂延迟时间：4.5 min。

1.3 样品处理

先用中药粉碎机粉碎样品，过250 μm (60 目)筛，取0.5 g 样品于50 mL 塑料离心管中，加入纯水10 mL，漩涡混匀1 min，加入乙腈10 mL，漩涡混匀1 min，置于高速离心机上，以10 000 r/min转速离心6 min，吸取上层清液2.0 mL 加入净化管中，漩涡混匀2 min，经微孔滤膜(孔径为0.22 μm)滤至进样瓶中，进行GC-MS测定。

2 结果与讨论

2.1 质谱参数的选择

通过全扫描模式获得待测组分的保留时间和特征离子峰，以选择离子扫描模式建立质谱分析方法，质谱参数见表1。

表1 糠醛类化合物色谱保留时间及特征离子

2.2 色谱柱的优化

分 别 考 察 了HP-INNOWAX、HP-5MS、HP-35MS 等3 种不同极性的色谱柱对4 种糠醛类化合物的分离效果，使用HP-5MS、HP-35MS色谱柱分离时，4种糠醛类化合物色谱峰拖尾严重，使用极性强的HP-INNOWAX色谱柱分离时，有较高的响应值，色谱峰形尖锐，糠醛类化合物均含有醛基，极性较强，故选用HP-INNOWAX色谱柱分离4种糠醛类化合物，4 种糠醛类化合物SIM 模式总离子流色谱图见图1。

图1 4种糠醛类化合物SIM模式总离子流色谱图

2.3 定量方法的确定

准确称取0.5 g 样品，于50 mL 塑料离心管中，加入0.5 mL 10.0 μg/mL 糠醛-d4、5-羟甲基糠醛-13C6混合标准工作液以及20 μL 0.5 mg/mL的糠醛、5-羟甲基糠醛混合标准使用液；另取0.5 g 样品，于50 mL塑料离心管中，只加入20 μL 0.5 mg/mL的糠醛、5-羟甲基糠醛混合标准使用液。两组样品均按照1.3进行样品处理，上机测定，结果见表2。从表2可以看出，相较于外标法，内标法测定样品的回收率和线性相关系数更好，因此采用内标法测定，其中糠醛以糠醛-d4作为内标，5-羟甲基糠醛以5-羟甲基糠醛-13C6作为内标，均为同位素内标。同位素内标是一种理想的内标物，具有与待测化合物极为相似的理化性质，所以在测试过程中的提取效率，净化过程的损失，基质影响等基本接近，可以用来校正这些因素带来的测试偏差，特别适用于采用质谱法检测时的痕量残留分析[17]。

表2 内标法和外标法定量结果

2.4 提取溶剂的优化

分别采用乙腈、丙酮、正己烷、乙酸乙酯进行样品提取，考察4 种溶剂的提取效果，4 种提取溶剂提取回收率见图2。由图2 可见，乙腈的提取效果最好，糠醛加标回收率为91.0%，5-羟甲基糠醛回收率为95.8%，明显优于其它3 种溶剂。糠醛、5-羟甲基糠醛属于极性物质，根据相似相溶原理，极性溶剂的提取效率较高，乙腈属于强极性溶剂，此外，乙腈作为提取溶剂时，不易提取油脂类物质，可以减少杂质干扰[13]，故最终选用乙腈作为提取溶剂。

图2 4种提取溶剂提取回收率

2.5 样品净化剂的优化

速溶咖啡基质比较复杂，含有色素、脂肪、蛋白质以及糖类等化合物[18]，净化去除这些干扰物质，既有利于提高回收率，保证检测结果准确、可靠，又可以延长色谱柱寿命。按照QuEChERS原则，分别选取SCX、PSA、GCB、C184种净化剂，设计了3种组合进行验证，以选取最佳的净化剂。分别考察AN50E011、5982-5021、5982-5321 3 种净化剂组合的净化效果，结果见图3。由图3 可见，速溶咖啡样品使用AN50E011 净化，糠醛加标回收率为88.3%，5-羟甲基糠醛回收率为94.1%，回收率明显高于其它2 种净化剂，因此最终选择AN50E011 作为净化剂。

图3 3种净化剂提取回收率

2.6 线性关系、检出限和定量限

用乙腈稀释，配制7种不同浓度的糠醛、5-羟甲基糠醛混合标准工作液，质量浓度分别为0.001、0.005、0.02、0.1、0.4、2.0、8.0 μg/mL，糠醛-d4、5-羟甲基糠醛-13C6为内标，内标质量浓度为1.0 μg/mL，以混合标准工作液质量浓度为横坐标、定量离子峰的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，以最小二乘法进行线性回归，得到线性方程和相关系数。

以3倍信噪比对应的质量分数作为方法的检出限，10 倍信噪比对应的质量分数作为方法的定量限。

线性范围、线性方程、相关系数、方法检出限与定量限结果见表3。从表3 可知，各组分线性良好，其线性相关系数均大于0.999，方法检出限、定量限满足检测需求。

表3 两种糠醛类化合物的线性方程、相关系数(r)、检出限(LOD)和定量限(LOQ)

2.7 加标回收试验

选取速溶咖啡样品分别在低、中、高3个加标水平进行回收试验，结果列于表4。由表4可知，糠醛、5-羟甲基糠的平均回收率为91.8%～96.8%，测定结果的相对标准偏差为2.8%～6.5%(n=5)，准确度和精密度良好。

表4 两种糠醛类化合物的平均加标回收率和相对标准偏差

3 结语

以乙腈提取，用100 mg C18、50 mg SCX、150 mg无水MgSO4净化，同位素内标法定量，建立了速溶咖啡中糠醛、5-羟甲基糠醛的GC-MS 测定方法，该方法简单快速、灵敏可靠，为速溶咖啡中糠醛、5-羟甲基糠醛的提取和检测提供了可靠的技术支撑。