miR-296-5p在糖尿病肾病db/db小鼠血浆外泌体中的表达及功能

刘 苏，徐巍龙，查 敏，李 楠，周静波，叶丽芳

南京中医药大学附属医院内分泌科，江苏 南京 210029

肾间质纤维化是糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）进展至终末期肾病的主要病理途径，转录因子Snail1介导的肾小管上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）通过旁分泌等作用，促进肌成纤维细胞的募集或增殖，是加速肾间质纤维化的重要环节之一［1］。Snail1 受到多种微小核糖核酸（miRNA，miR）的调控［2］，血浆/血清外泌体包裹的miRNA 具有高稳定性、源细胞特征及靶向功能性［3］，是体内各组织/器官间细胞通讯的新途径［4］，血浆外泌体miR-296-5p 与肿瘤细胞的EMT相关［5］，目前尚无miR-296-5p在DN血浆外泌体中表达及对肾小管上皮细胞EMT 影响的相关研究，因此，本研究拟通过DN小鼠模型，利用外泌体RNA测序及生物信息学分析等手段，明确miR-296-5p 在DN 小鼠血浆外泌体中的表达变化，并进一步探索其参与糖尿病肾病EMT进程的可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料

动物：10周龄SPF级健康雄性db/db小鼠12只，雄性db/m小鼠12只，体重20～45 g，由南京大学实验动物中心提供［动物许可证号：SCXK（苏）：2018-0008］。

主要试剂：exoRNeasy Midi Kit（Qiagen 公司，美国）；miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stemloop）、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物）；Snail1 野生型双荧光素酶报告质粒、Snail1突变型双荧光素酶报告质粒（安徽通用生物）；miR-296 mimics、NC（苏州吉玛基因）；293T 细胞（ATCC，美国）；LipofectamineTM2000（Invitrogen 公司，美国）；DMEM 高糖、FBS（Hyclone 公司，美国）；青链双抗（上海生工生物）；双荧光检测试剂盒（Promega公司，美国）；苏木素-伊红染液试剂盒（南京凯基生物）。

主要仪器：荧光定量PCR仪（ABI7300）、细胞培养箱（Thermo）、荧光倒置显微镜（OLYMPUS，IX71）、超净工作台（苏州安泰科技有限公司）、低温冷冻离心机（Sigma 3K15）、脱色摇床（海门市其林贝尔TS200A）、发光检测仪（Molecular Devices SpectraMax®i3）、超速离心机（Himac CP80WX）、透视电子显微镜（Tecnai）、ZetaView Particle Metrix（Particle Metrix）。

1.2 方法

1.2.1 分组及取样

首先选取6只10周龄db/db小鼠为模型组，6只10周龄db/m小鼠为对照组，在南京医科大学实验动物中心适应性喂养2 周，麻醉后对小鼠行眼眶采血致死，血浆混样后行外泌体RNA 测序及生化检测。完成差异miRNA 筛选后，再次选取6 只10 周龄db/db 小鼠为模型组，6 只10 周龄db/m 小鼠为对照组，重复上述饲养及处死流程，血浆混样后行外泌体鉴定及外泌体miRNA 验证。24 h 尿液标本利用代谢笼收集。肾组织标本部分冻存于液氮中，用于RNA和蛋白提取；部分保存于多聚甲醛，包埋后用于Masson 染色及免疫组化。动物实验按照南京医科大学实验动物福利伦理委员会规定进行操作，伦理批件编号：IACUC-2103058。

1.2.2 小鼠生化指标检测

血、尿标本送南京润太医学检验有限公司实验室，测定血尿素（BUN）、血肌酐（Scr）、血胱抑素C（Cys-C）、空腹血糖（FBG）、24 h尿蛋白定量（Upro）。

1.2.3 小鼠血浆外泌体miRNA测序

分别取2 mL db/m 组和db/db 组小鼠血浆，送上海其明生物技术有限公司进行血浆外泌体miRNA测序，并利用生物信息学软件进行分析。按|log2FC|值由高到低进行验证。

1.2.4 血浆外泌体提取

分别取2 mL db/m 组和db/db 组小鼠血浆，采用差速超速离心法，予300g，4 ℃离心10 min；取上清液，2 000g4 ℃离心10 min，12 000g4 ℃离心30 min；120 000g4 ℃离心70 min，取透明沉淀重悬于PBS，所得即为外泌体溶液；取其中20 μL，加入PBS后再次120 000g4 ℃离心70 min，取透明沉淀重悬于PBS，所得即为电镜使用。

1.2.5 透视电子显微镜及纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analyze，NTA）鉴定外泌体

外泌体样本静置于铜网上1 min，2%醋酸双氧铀染色液室温染色1 min，将染色完成的样本放于灯下烤10 min，透射电镜观察拍照，保存图片。外泌体样本以1×PBS buffer 稀释，使用ZetaView PMX110进行NTA，结合Stockes-Einstein 方程式计算外泌体粒径和浓度。

1.2.6 小鼠血浆外泌体RNA提取

使用QIAGEN exoRNeasy Midi Kit 试剂盒直接提取血浆外泌体RNA，步骤为：加等体积Buffer XBP到样品中，500g离心1 min；5 000g离心1 min，将离心柱转移到新的收集管中，加700 μL QIAzol 到膜上，5 000g离心5 min，收集裂解液，室温孵育5 min；加入90 μL 氯仿，震荡15 s，室温孵育2～3 min，4 ℃12 000g离心15 min；转移上层水相到新的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀；转移混合样品到离心柱中，放入2 mL收集管中，室温，＞8 000g离心15 s；加700 μL Buffer RWT到离心柱中，＞8 000g离心15 s；加500 μL Buffer RPE到离心柱中，＞8 000g离心15 s，重复这一步骤；将离心柱转移到新的收集管中，开盖全速离心5 min使膜晾干；将离心柱放入新的1.5 mL离心管中，加14 μL水到膜中央，室温放置1 min，全速离心1 min，获得的RNA放-80 ℃冰箱备用，行血浆外泌体miRNA验证。

1.2.7 实时定量qPCR（RT-qPCR）检测

外泌体RNA 提取、逆转录及荧光定量PCR 反应体系及程序参照试剂说明书，miR-296-5p 和Snail1 mRNA 的表达情况用2-ΔΔCt方法进行相对定量分析，分别以U6 和GAPDH 为内参，引物序列见表1。

表1 用于RT-qPCR的引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.2.8 生物信息学分析

利用TargetScan、miRanda软件，预测靶向Snail1的miRNA，取两种软件预测结果的并集。mmu-miR-296-5p成熟体序列来自miRBase 数据库。利用TargetScan 软件预测mmu-miR-296-5p 与Snail1 的结合位点，根据结合位点碱基序列设计突变型载体序列，突变序列为：5′-ACATGTCCAGGTGCCCCTGGGCCTGGGCAACTGTTTCAGCCCCCGCCCCCAT -TTGTCCTGGTGACACCTGTTTCACAGCAGTTTAACTGTCTCAGAAGGGACCATGAATAATGGCCATCACTTGTTAGGGGCCAAGTGGGGTGCTTCAGCCTGGC -CAATGTGTCTCCCAGAACTATTTTCCCCGGGTACAGGTGGCCCCGGGAGAAAGATGTTTACATTTTAAAGGTATTTATATTGTAAGCAGCATTTTGTATAGTTAATATGTACAGT T T ATTGATATTCAATAAAATGGTTAATTTATATACTAAAAA-3′（下划线部分为结合位点突变后的基因序列）。

1.2.9 双荧光素酶实验

构建野生型和突变型的Snail1-UTR 双荧光报告质粒（Snail1-WT，Snail1-MUT）。将对数生长期的293T 细胞以1×105个/mL 接种至24 孔培养板，每孔500 μL。将Snail1-WT、Snail1-MUT 与miR-296-5p mimics 和mimics NC 按照LipofectamineTM2000 说明书步骤转染至293T 细胞，每组实验设置3 个重复。培养箱内培养48 h后，参照双荧光素酶报告基因检测试剂盒步骤检测荧光素酶活性。

1.2.10 小鼠肾组织病理学检查

肾组织用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，4 μm 切片，Masson、HE染色后光镜下观察肾组织病理学变化。免疫组化分析小鼠肾组织E-cadherin、α-SMA及Snail1蛋白表达。定量方法为将每个指标db/m 组小鼠的染色面积作为1，db/db组小鼠的染色面积与db/m组小鼠的染色面积的比值即为该指标的相对表达量。

1.3 统计学方法

数据分析采用GraphPad Prism 5 软件，计量资料采用均数±标准差（）表示，两组间比较采用student-t检验；计数资料采用频数和百分比（%）表示，两组间比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠代谢及生化指标比较

与db/m组比较，db/db组小鼠24 h尿蛋白定量、血尿素、血肌酐、血胱抑素C、空腹血糖、体重均升高，其中Upro、FBG、体重升高显著（P=0.003，P＜0.001，P＝0.020），符合2 型糖尿病肾病小鼠临床表现（表2）。

表2 小鼠尿蛋白、肾功能、血糖及体重比较Table 2 Comparison of urine protein，renal function，blood glucose and weight in mice （，n=6）

表2 小鼠尿蛋白、肾功能、血糖及体重比较Table 2 Comparison of urine protein，renal function，blood glucose and weight in mice （，n=6）

2.2 小鼠血浆外泌体鉴定

电镜视野下，两组小鼠血浆均可见少量外泌体样结构（图1）。NTA 结果显示，db/m 组小鼠血浆外泌体的颗粒检测浓度为6.4×107个/mL，平均粒径132.1 nm；db/db组小鼠血浆外泌体的颗粒检测浓度7.7×107个/mL，平均粒径126.8 nm，均符合外泌体分布范围，两组血浆外泌体粒径比较，差异无统计学意义（P=0.890）。

图1 透视电镜及NTA技术鉴定小鼠血浆外泌体Figure 1 Characterization of mouse plasma exosomes by transmission electron microscope and NTA

2.3 小鼠血浆外泌体miRNA测序分析及验证

db/m 组、db/db 组小鼠血浆外泌体行miRNA 测序，通过TargetScan、MiRanda软件，并集筛选出32个靶向Snail1的差异miRNA，其中17个miRNA表达上调，15个miRNA表达下调（表3）。

表3 靶向Snail1的小鼠血浆外泌体差异miRNATable 3 Sequencing results of different plasma exosomal miRNA targeting Snail1

按照|log2FC|值由高到低顺序，利用小鼠肾组织行RT-qPCR 验证，优先检测TargetScan、MiRanda 软件中重复的miRNA。结果显示，与db/m 组相比，db/db 组小鼠肾组织mmu-miR-296-5p 降低，mmu-miR-34a-5p 升高（P=0.001，P=0.011），差异有统计学意义（图2）。进一步利用小鼠血浆外泌体行RT-qPCR 验证，发现db/db 组小鼠血浆外泌体中mmu-miR-296-5p 表达下降，mmu-miR-34a-5p 表达升高（P=0.011，P=0.013），差异有统计学意义（图3）。结合|log2FC|值，选取miR-296-5p为本研究目标miRNA。

图2 RT-qPCR验证小鼠肾组织miRNA表达Figure 2 Verification of miRNAs in mouse kidneys by RT-qPCR

图3 RT-qPCR验证小鼠血浆外泌体miRNA表达Figure 3 Verification of miRNAs in mouse plasma exsomes by RT-qPCR

2.4 双荧光素酶实验检测mmu-miR-296-5p与Mus-Snail1的靶向关系

TargetScan 软件预测mmu-miR-296-5p 与Snail1 3′UTR 的结合位点位于Snail1 3′UTR 区596～603 位置（图4）。双荧光素酶报告基因检测实验结果显示：与miR-296-5p mimics NC组相比，miR-296-5p mimics组Snail1-WT 细胞的荧光素酶活性强度明显降低（P＜0.001）；Snail1-MUT 细胞的荧光素酶活性强度无明显变化（P=0.060）；Snail1-WT 细胞miR-296-5p mimics 组与Snail1-MUT 细胞miR-296-5p mimics组比较，荧光素酶活性强度差异有统计学意义（P=0.003，图5），证明miR-296-5p靶向结合Snail1。

图4 Snail1与miR-296-5p的结合位点序列图Figure 4 Sequence of the binding sites of Snail1 and miR-296-5p

图5 双荧光素酶检测结果Figure 5 Results of dual luciferase assay

2.5 RT-qPCR检测小鼠肾组织EMT相关基因表达水平

与db/m 组相比，db/db 组小鼠肾组织中E-cadherin mRNA 表达下调（P=0.012），α-SMA mRNA 表达上调（P=0.042），差异有统计学意义；Snail1 mRNA表达极度上调（P＜0.001，图6），提示db/db 小鼠肾组织存在α-SMA阳性肌成纤维细胞增殖及Snail1介导的EMT。

图6 RT-qPCR 检测小鼠肾组织中E-cadherin、α-SMA 及Snail1 mRNA表达Figure 6 The mRNA expression of E-cadherin，α-SMA and Snail1 in mouse kidney by RT-qPCR

2.6 小鼠肾组织病理切片的观察

Masson染色见db/m组小鼠肾小球大小正常，无肾小管扩张、萎缩，细胞外Masson 染色阳性面积小于视野面积的10%。db/db 组小鼠肾小球、肾间质均见Masson 阳性染色，肾小管扩张明显，细胞外Masson 染色阳性面积占视野面积的50%左右。HE染色见db/m 组小鼠系膜基质无增多，肾小管上皮细胞形态正常；db/db 组小鼠肾小球中性粒细胞浸润，系膜基质增多，间质见炎症细胞、浆细胞浸润（图7）。db/db小鼠肾组织呈现间质炎症、纤维化的病理表现。

图7 Masson、HE染色观察小鼠肾组织形态学（×100）Figure 7 The morphology of mouse kidney by Masson and HE staining（×100）

2.7 免疫组化染色观察小鼠肾组织中E-cadherin、α-SMA、Snail1蛋白表达水平

与db/m组相比，db/db组小鼠E-cadherin蛋白表达量下降，差异具有统计学意义（P=0.020）；α-SMA蛋白表达量有上升趋势（P=0.152），但无统计学差异；Snail1蛋白表达量明显增加（P=0.005，图8）。

图8 免疫组化染色观察小鼠肾组织E-cadherin、α-SMA、Snail1的表达（×100）Figure 8 The expression of E-cadherin，α-SMA and Snail1 in mouse kidney by immunohistochemical staining（×100）

3 讨论

肾间质纤维化的主要特征是α-SMA 阳性肌成纤维细胞增殖和细胞外基质过度沉积，是DN 肾功能进行性下降的主要原因之一。目前研究显示，肾小管上皮细胞EMT 不是肌成纤维细胞的主要来源［6］，而是通过诱导上皮细胞周期阻滞［7］、促进肌成纤维细胞分化及维持间质炎症等方式［8］，加速肾间质纤维化。因此，明确EMT 的调控机制，对防治糖尿病肾病至关重要。

EMT 的本质是上皮细胞向间充质细胞表型转化的过程，在糖尿病背景下，损伤的肾小管上皮细胞E-cadherin表达下调，细胞丧失黏附特性，逐渐从基底膜上脱落，表达α-SMA 间充质细胞表型，并通过断裂的肾小管基底膜移行到肾间质中。本研究中，12 周龄db/db 小鼠肾组织病理见间质炎症细胞浸润，Masson 染色阳性；肾组织α-SMA 基因表达增加，蛋白表达有上升趋势，符合早期DN肾小管间质纤维化改变。与此同时，肾组织E-cadherin 基因和蛋白下调显著，提示在DN 肾小管间质病变早期即存在上皮细胞EMT，EMT与间质炎症及肌成纤维细胞增殖相关。本研究免疫组化检测未见α-SMA 蛋白显著上升，可能和造模时间短、肾间质病变早期纤维化程度不严重有关。

E-cadherin 表达减少或缺失是EMT 的标志，受到转录因子Snail1的调节［9］。在肾脏上皮细胞正常分化过程中，低表达的Snail1 可维持肾组织结构及内环境稳态；而病理状态下，升高的Snail1与E-cadherin 启动子的E2-box 特异性结合，抑制E-cadherin基因的转录，下调E-cadherin 表达，触发上皮细胞EMT［10］。既往文献报道，Snail1 在糖尿病肾病、IgA肾病、微小病变肾病等多种肾脏疾病中均可升高，而在DN时升高显著［11］。肾纤维化小鼠模型［12］及肾小管上皮细胞EMT 模型［13］进一步证实，升高的Snail1 可诱导肾小管上皮细胞EMT。本研究db/db小鼠肾组织Snail1 基因及蛋白表达显著增加，而E-cadherin 降低明显，结合文献资料，本研究提出，DN 时，肾组织局部Snail1 表达增加，通过下调E-cadherin，诱导了肾小管上皮细胞EMT。

Snail1又受到多种miRNA的靶向调控［2，14］，而血浆或血清中的miRNA 发挥调控功能需要外泌体介导。首先，外泌体是循环miRNA 的主要存在形式，其特殊的脂质双层膜结构将miRNA 与外界核酸酶相隔绝，相比血循环中游离的miRNA，外泌体中的miRNA具有良好的生物稳定性。其次，外泌体由来源细胞主动胞吐释放到细胞外，其包裹的miRNA能够直接反映机体的生理病理状态，在癌症［15］、脂肪营养不良［16］、心血管疾病［17］等疾病中，循环外泌体miRNA表达谱呈特异性改变，是疾病诊断的新型标志物。本研究通过小鼠血浆外泌体miRNA 测序及RT-qPCR 验证，发现db/db 小鼠miRNA 在血浆外泌体中呈差异表达，其中miR-296-5p 显著下调，可能是DN潜在的生物标志物。本研究认为，miR-296-5p在db/db 小鼠血浆外泌体表达下降，是在糖尿病背景下，肾脏及肾外组织功能障碍的共同结果。首先，肾脏作为DN的主要病变器官，可能释放富集差异表达miRNA 的外泌体［18］；其次，脂肪细胞被认为是循环外泌体miRNA 的主要来源［16］，在高糖背景下，包括肾脏、脂肪在内的胰岛素敏感组织均可出现功能障碍，血浆外泌体miR-296-5p的来源细胞有待后续研究进一步明确。

目前血浆外泌体miRNA 的研究多围绕疾病诊断及病情评估，其靶向调节功能的相关研究甚少，血浆外泌体可通过直接融合胞膜或内陷胞吞、水平转移miRNA 等进入靶细胞，调控靶细胞基因。本研究miR-296-5p 在db/db 小鼠肾组织中表达下调，与血浆外泌体中表达一致，双荧光素酶检测提示，miR-296-5p与Snail1存在靶向关系，因此，本研究提出，表达下调的miR-296-5p可能通过血浆外泌体递送，靶向上调肾小管上皮细胞Snail1，诱导肾小管上皮细胞EMT，加速DN肾间质纤维化。

综上所述，miR-296-5p在DN db/db 小鼠血浆外泌体中表达显著下降，是DN 的潜在生物标志物之一。同时，本研究在动物实验水平提出，表达下调的miR-296-5p可能通过血浆外泌体递送，靶向上调肾小管上皮细胞Snail1，诱导肾小管上皮细胞EMT，加速DN 肾间质纤维化，但仍需通过细胞实验及药物干预实验等进一步验证。