大鼠骨质疏松模型的建立及其骨髓间充质干细胞内差异lncRNA初步分析

刘易昕，何 强，张大鹏，严 坤，姚年伟，钱卫庆

南京中医药大学附属南京中医院骨伤科，江苏 南京 210000

骨质疏松是全世界范围内的健康难题，其发病与成骨、破骨代谢之间的失衡有关。促进骨形成、探究其相关分子生物学机制，对防治骨质疏松具有重大意义。骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC）是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞群，在体内不同环境下可分化为成骨细胞、软骨细胞以及脂肪细胞，其分化去向在全身的骨代谢中起到了重要作用［1］，外部因素及其信号处理过程如何调控BMSC分化去向是当前研究的热点。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是高度结构化的RNA转录本，长度超过200 个核苷酸，不直接参与蛋白的翻译过程［2］。起初认为lncRNA 不具备生物学功能，近来研究发现lncRNA 可广泛参与基因的表达调控，调节细胞的增殖、分化、凋亡，并与个体的生长发育相关［2］。研究表明，lncRNA 在基因水平对BMSC的调控起重要作用，参与BMSC 分化调控过程中复杂的信号通路，从而间接调控骨质疏松疾病的发生和发展［3-6］，但具体调节机制仍不明确。本研究拟通过制备卵巢切除骨质疏松模型，并培养骨质疏松模型大鼠的BMSC，对细胞内lncRNA 进行检测，对比研究相关差异lncRNA 基因的生物学功能及参与的相关信号通路，为后期进一步的验证及功能研究提供基础。

1 材料和方法

1.1 材料

选取雌性SD 大鼠12 只，体重（250±10）g，由南京医科大学实验动物中心提供。所有实验均通过南京市中医院伦理委员会批准同意。12只SD大鼠分为对照组和骨质疏松组，每组6 只。骨质疏松组采用切除卵巢的方法制作模型，对照组仅采用腹部切开不作卵巢切除，均饲养3个月。3个月后每组取3只SD大鼠的BMSC用于基因芯片检测。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠卵巢切除骨质疏松模型建立

根据文献方法制作SD大鼠骨质疏松模型［7］，采用10%水合氯醛以1 mL/250 g的剂量腹腔内注射麻醉，待麻醉满意后大鼠腹部剪毛，采用碘伏进行局部皮肤消毒，沿着腹部中线中下部正中作2 cm长切口，将皮肤牵开，切开腹膜，进入腹腔，沿双侧子宫外上角的输卵管找到卵巢，丝线结扎卵巢蒂部，切除大鼠卵巢并取出，缝合腹膜和皮肤切口。对照组SD大鼠仅切开腹部后沿着输卵管显露卵巢，但不作卵巢切除，缝合腹膜及皮肤。

1.2.2 骨密度（bone mineral density，BMD）检测

根据实验设计，在实验开始时和饲养3 个月后分别检测SD 大鼠的骨密度并进行比较。采用10%水合氯醛以1 mL/250 g 剂量腹腔内注射麻醉，待麻醉满意后，将其四肢展开俯卧于双能X 线吸收测量仪（GE 公司，美国）平台上，通过小动物软件测定系统测定各组小鼠全身骨骼的骨密度。

1.2.3 BMSC的分离提取、培养及鉴定

饲养3个月后的SD大鼠，根据文献介绍方法［8］，取大鼠右侧股骨干，无菌条件下沿两侧干骺端剪断，暴露骨髓腔，并以1 mL 无菌注射器吸取培养基反复冲洗，直至流出的液体变为清亮并且骨的颜色发白；用移液器将含有小鼠骨髓液的培养基转移至15 mL离心管，轻柔吹打，去除残渣，经离心、重悬后以1×106个/瓶的浓度接种于培养皿内，置于培养箱中，每隔2 d 更换1 次培养液，待细胞融合约80%～90%时进行传代操作。选取第3代BMSC，常规消化并制备细胞悬液，1 000 r/min 室温离心5 min 后PBS缓冲液重悬细胞，并调整浓度5×106个/mL加入流式细胞管，在避光条件下按说明书每管分别加入荧光标记的CD45、CD90抗体，4 ℃避光孵育1 h，对细胞进行1 000 r/min 室温离心5 min 后PBS 洗涤3次，将细胞重悬于加入约1 mL PBS缓冲液，运用流式细胞仪检测并计算阳性细胞的比例，结果显示CD45+细胞比例＜1%，而CD90+细胞比例＞95%。

1.2.4 基因芯片检测差异lncRNA

根据实验设计，取饲养3 个月后的骨质疏松模型组大鼠3 只和对照组大鼠3 只，培养其BMSC，利用基因芯片技术检测BMSC内差异lncRNA。

在Illumina TruSeq™RNA 样品准备试剂盒使用说明书指导下进行RNA提取及文库的制备，最后进行PCR 富集得到最终的cDNA 文库。利用Trimmomatic（v0.32）进行基因数据质量过滤，保留基因质量在20 以上的碱基。基因差异表达的计量数据为基因表达水平分析中得到的readcount 数据。采用deseq进行分析，采用Quantile的Normalization方法，选取P＜0.05、差异倍数＞2即|log2FC|＞1的基因作为差异表达的基因列出。

1.2.5 GO功能和KEGG信号通路富集度分析

通过GO 分类号和GO 数据库相关分析工具将分类与具体基因联系起来，对基因的功能进行描述，通过分析明确差异基因主要参与的生物功能。对差异表达lncRNA 的共表达靶基因mRNA 做KEGG 信号通路富集分析，判定差异基因主要影响的生物学功能或者信号通路。

1.3 统计学方法

采用SPSS22.0统计学软件包进行数据分析，所有数据以均数±标准差（）表示。采用Shapiro-Wilk法检验数据是否服从正态分布，对符合正态分布的计量资料，两组数据比较采用t检验，多组数据比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠骨密度变化

所有12只大鼠均顺利完成手术并饲养3个月。骨质疏松模型组和对照组SD 大鼠术前骨密度差异无统计学意义［（182.33±4.50）mg/cm2vs.（184.17±4.49）mg/cm2，P＞0.05］；骨质疏松模型组SD 大鼠3 个月后骨密度为较对照组大鼠显著降低［（157.33±6.28）mg/cm2vs.（183.33±4.50）mg/cm2，P＜0.05］，同时较切除卵巢前显著降低（P＜0.05，图1）。

图1 SD大鼠骨密度检测Figure 1 Bone mineral density of SD rats

2.2 大鼠BMSC内lncRNA的差异表达

骨质疏松模型组和对照组SD 大鼠BMSC 内检测出基因片段共计32 759 个，差异有统计学意义（P＜0.05）的有8 454个，其中上调3 593个，下调4 861个。检测到的lncRNA基因片段共4 992个，按照|log2FC|＞1、P＜0.05 的评价标准，骨质疏松模型组和对照组大鼠BMSC 内共116 个lncRNA 差异有统计学意义（P＜0.05），占所有lncRNA 基因的2.3%，其中上调35个，下调81个。聚类热图和火山图分析结果提示差异谱结果可靠（图2）。

图2 SD大鼠BMSC内的lncRNA表达情况Figure 2 LncRNA expression in BMSC of SD rats

2.3 差异lncRNA高级分析结果

通过高级分析最终筛选出18个lncRNA差异具有统计学意义（P＜0.05），其|log2FC|值均在6 以上，其中上调的基因数为3个，占总数的16.7%，下调的基因个数为15个，占总数的83.3%。通过“cis”调控机制来预测差异lncRNA 的靶基因4 532 个，上述|log2FC|值均在6 以上的18 个lncRNA 的预测下游mRNA基因见表1。

表1 表达显著差异的lncRNA列表及预测的靶向基因Table 1 List of significantly differentially expressed lncRNA and predicted target genes

对基因芯片技术检测到的差异基因、同时又被预测为差异lncRNA 可能调控靶标的编码基因，取交集共计273 个基因进行GO 分析、KEGG 信号通路富集度分析（图3）。根据GO 功能分析，生物学过程（BP）中基因分布前5 位的分别是发育过程（GO：0032502）、细胞生长（GO：0001558），解剖结构的发育（GO：0048856）、刺激反应（GO：0048583）和细胞蛋白代谢过程（GO：0032268）。细胞成分（CC）方面，显著差异lncRNA 主要存在于异染色质、与膜相连的细胞器、核内腔、激活素A复合体内。

图3 差异lncRNA相关分析Figure 3 Results of differential lncRNA advanced analysis

差异lncRNA 主要富集的KEGG 信号通路，前5 个信号通路分别是：蛋白的转运通路、味觉的传导通路、核黄素的新陈代谢通路、泛酸盐和辅酶A的生物合成通路与扩张型心肌病相关通路，这些通路可能间接调控骨质疏松的病理生理过程。

3 讨论

随着社会老年化人口的增加，骨质疏松的发病率越来越高，其发病可以归因于不平衡的成骨和破骨过程，但是其更详细的发病机制尚不清楚。卵巢切除是制作骨质疏松模型的方法之一［7］。通过对卵巢切除骨质疏松模型与正常大鼠的骨密度结果对比发现，卵巢切除3 个月后，SD 大鼠的骨密度显著降低，进一步说明骨质疏松模型制作成功。

BMSC 是成骨细胞、破骨细胞和脂肪细胞等的前体干细胞，其向不同方向分化对成骨形成和破骨吸收平衡作用至关重要［1］。抑制BMSC成脂、破骨分化，促进其成骨分化，纠正骨代谢失衡是治疗骨质疏松的研究方向之一［9-10］。在骨质疏松的发病过程中，lncRNA 参与了细胞增殖、凋亡和炎症反应的调控，lncRNA在骨质疏松中的具体作用机制尚不明确［11］。

lncRNA 对BMSC 的成骨分化发挥重要作用。通过对人BMSC 的研究发现，下调lncRNA ENST00000502125.2 可导致BMSC 内的碱性磷酸酶染色强度明显增强，染色结节的数也显著增多，表明细胞向成骨性细胞分化［5］。lncRNA H19在BMSC成骨分化过程中表达显著，miR-140-5p表达显著降低，功能分析显示lncRNA H19过度表达可抑制miR-140-5p 表达，加速成骨BMSC 分化，而lncRNA H19缺失则抑制了BMSC 的成骨分化过程，lncRNA H19可调控BMSC 分化过程［3］。同样，lncRNA MEG3 的下调能显著抑制BMSC 的成骨能力，其过表达则能提高BMSC 的成骨能力，其对成骨分化的调节作用可能是通过激活骨形态发生蛋白4（BMP-4）来实现的［6］。

本研究中，在骨质疏松模型大鼠BMSC 内有116个lncRNA的表达差异具有统计学意义，占所有lncRNA 基因的2.3%，其中上调的lncRNA 35 个，下调81个。根据GO功能分析，这些差异lncRNA主要参与细胞生长发育、解剖结构发育的调控、对应激反应的调节、对细胞蛋白代谢过程的调控。差异lncRNA 主要富集的KEGG 信号通路包括蛋白的转运通路、味觉的传导通路、核黄素的新陈代谢通路、泛酸盐和辅酶A的生物合成通路与扩张型心肌病相关通路，这些通路可能间接调控骨质疏松的病理过程，本研究结果可为后续动物体内体外实验、临床试验等进一步探索并验证lncRNA 对骨质疏松发病的影响提供基础。