不同LED光质对培养火龙果胚性愈伤组织的影响

黄文静，杨光柱，刘丹丹，李 帆，郑丽萍，马 钧

(1 云南省农业科学院园艺作物研究所/云贵高原果树科学观测试验站，昆明，650205；2 云南大学农学院，昆明，650205)

植物愈伤组织是培养悬浮细胞和获得原生质体的优良材料，可用于研究植物生长发育及分化的机制、遗传变异规律，或用于细胞培养筛选、细胞融合中原生质体的来源等。愈伤组织培养不仅是一种植物快繁手段，同时也是植物改良、种质保存、有用化合物生产的理想途径[1]。光是植物生长重要因素之一，对植物生长发育至关重要，影响叶绿素a、叶绿素b对光的吸收，从而影响光合作用的光反应阶段；同时还作为一种信号影响植物生长代谢、物质运输、果实品质等。有研究表明，不同LED光质对番茄、萝卜、草莓果实的着色有益，对豌豆苗、生菜品质有益[2]，对火龙果、苹果砧木组培苗分化有益[3-4]，但在火龙果愈伤组织培养上的应用研究较少。因此，本研究采用5种不同配比的LED光质，筛选对火龙果胚性愈伤组织生长适宜的光照组合，为植物愈伤组织培养中LED光源的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

2020年在云南省农业科学院园艺作物研究所果树中心实验室进行试验，红皮红肉“玫瑰红龙”火龙果成熟胚，种胚消毒灭菌后采用芽诱导培养液1/2 MS+0.1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+20 g/L蔗糖，培养温度(25±2) ℃，光照为全白光12 h/d，诱导15 d左右，可诱导出两片子叶，25 d左右子叶中部生长出幼芽，切除根系后接入愈伤组织诱导培养基1/2MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA+20 g/L蔗糖+7 g/L琼脂，每瓶10个，50瓶1组分别放置于不同光质处理下培养，所有培养基pH值5.8，121 ℃高压灭菌20 min。

1.2 LED光质条件设置

LED光照培养采用专利号为ZL 2019.2.1299069.3的节能组培架，LED光源置于每层顶部，垂直照射，设置LED白光、红光、红光+蓝光、绿光+蓝光、红光+绿光、红光+蓝光+绿光等6个处理；光照强度分别13.5～14.0、14.6～14.9、14.4～14.8、14.3～14.5、14.3～14.9、14.3～14.9 μmol·m-2·s-1，白光波长424～724 nm，波长峰值459 nm，红光波长606～657 nm，波长峰值635 nm，蓝光波长440～500 nm，波长峰值465 nm，绿光波长488～562 nm，波长峰值517 nm。火龙果成熟胚接种愈伤组织诱导培养基后，放置于不同光质处理培养室，12 h/d；另设置红光+绿光培养下，每天分别照射8、12、16 h等处理时长，培养温度(25±2) ℃，比较不同处理愈伤组织鲜质量差异和细胞活性。

1.3 愈伤组织生长量测定

接种后第20天开始，每隔10 d，分别取不同光质处理30个愈伤组织称量其鲜质量，连续测量5次，比较不同光质处理的愈伤组织生长量。

1.4 细胞活性测定

接种后每7 d测定不同光质处理火龙果愈伤组织细胞活性1次，方法参考刘华等[16]的TTC法，吸光度(OD值)即代表细胞活性，吸光度越大，细胞活性越大。

1.5 光照时长的影响测定

红光+绿光处理下，接种后每7 d测量不同光照时长处理下火龙果愈伤组织鲜质量及细胞活性。

1.6 数据处理

采用SPSS 23软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同光质对愈伤组织生长的影响

从表1看出，不同光质处理下，愈伤组织增殖速率呈稳定增长状态，红光+绿光处理对火龙果愈伤组织鲜质量增殖效果最好，培养30 d鲜质量32.1 g，培养70 d鲜质量41.3 g，其余处理愈伤组织鲜质量从高到低依次为白光>红光+蓝光>绿光+蓝光>红光+蓝光+绿光>红光，红光处理培养30 d鲜质量14.1 g，培养70 d鲜质量22.8 g。不同光质处理均能使火龙果愈伤组织增殖，但差异不显著。

表1 不同LED光质处理的火龙果愈伤组织生长情况比较

2.2 不同光质对愈伤组织细胞活性的影响

从图1可以看出，除红光处理外，其余处理愈伤组织细胞活性7～21 d均呈上升趋势，在第28天时达到顶峰，28～42 d平缓增长，42 d后下降，49～70 d缓慢下降。其中红光+绿光处理下，愈伤组织细胞活性最高，在第28天达到峰值0.78，后下降，49～56 d有小幅度上升，56～70 d缓慢下降。红光处理下14 d前细胞活性有所下降，后呈上升趋势，35～42 d达到峰值0.47。说明红光+绿光处理对火龙果愈伤组织培养效果较好，可在较短时间内使火龙果愈伤组织细胞大量生长且活性较高。

图1 不同LED光质处理的火龙果愈伤组织细胞活性(OD值)比较

2.3 同光质不同处理时长的影响

从图2可以看出，红光+绿光12 h/d处理对火龙果愈伤组织增重效果最佳，平稳增重，8 h/d处理次之，16 h/d处理最弱。说明照射12 h/d最有利于愈伤组织细胞鲜质量增长。

图2 红光+绿光不同时长处理对火龙果愈伤组织鲜质量的影响

从图3可以看出，红光+绿光不同时长处理的愈伤组织细胞活性都在第28天达到顶峰，28～42 d缓慢下降，42～49 d下降迅速，49～56 d时小幅上升，56～70 d平稳下降。光照12 h/d第28天细胞活性最高，为0.78，说明12 h/d处理的愈伤组织细胞活性最佳。

图3 红光+绿光不同时长处理对火龙果愈伤组织细胞活性的影响

3 结论与讨论

本研究中，火龙果愈伤组织鲜质量在不同光质条件下均随培养时间平稳增加。红光+绿光处理更有利于火龙果愈伤组织生长，培养70 d时愈伤组织鲜质量为41.3 g；细胞活性在培养28 d时达到最高，为0.78；培养28～42 d细胞活性较高，为0.75～0.78，42 d后细胞活性急速降低，可能与培养基中养分消耗殆尽有关，此时需及时更换培养基，以保证愈伤组织有充足养分持续生长。总体看来红光+绿光最有利于火龙果胚愈伤组织培养，相同培养时间内可获得更多的愈伤组织，且细胞活性最佳。单纯红光不利于火龙果愈伤组织生长，且细胞活性最低。

目前不同波长光质在植物培养过程中应用越来越广泛，光质对植物形态发生、光形态建成、生长控制、代谢物含量影响及各种反应机制的研究也越来越深入，不同光质对植物愈伤组织、原生质体培养过程中的生长、分化有一定影响[5]。不同LED光质处理中，黄光有利于白萝卜下胚轴和子叶的分化，绿光对愈伤组织诱导有一定抑制作用，蓝红光对愈伤组织的诱导效应不及单色光[6]，这与本研究红光+绿光有利于火龙果愈伤组织生长的结果不相符。

有研究发现，油菜采用一定强度的单色光处理，可以缩短外植体的启动时间，促进愈伤组织增殖[7]。以河套密瓜外植体培养愈伤组织，红蓝混合光对子叶和叶片愈伤组织形成比单色光弱，且发育不良[8]。LED橙光和LED红光处理下龙眼胚性愈伤组织生长缓慢、长势较差，呈水浸状态；LED蓝光和LED绿光处理下的愈伤组织水浸状，颜色褐黄，生长量最小，长势最差[9]。研究不同光质对葡萄愈伤组织生长的影响发现，绿光、黄光有利，蓝光和红光次之[10]。黄瓜、番茄在蓝光和红光下的生物量最大，绿光次之[11]。对龙眼胚性愈伤组织[12]、石刁柏愈伤组织培养[13]发现，蓝光、红光对愈伤组织的生长有促进作用。蓝光和黄光对白桦愈伤组织的增殖生长具有明显的促进作用，绿光次之，红光对愈伤组织的增殖效果不明显[14]，这与本研究单纯红光对火龙果愈伤组织生长增殖效果不明显相符。这些研究结果与本研究所得结果有一定差异，这可能由于不同植物愈伤组织对光质的需求不同。对于不同LED光质对火龙果愈伤组织的次生代谢物是否有影响，需要进一步研究。