香茅精油熏蒸对番木瓜炭疽病的防治效果及生理生化机制分析

陈晓晶，谷 会，帅希祥，杜丽清

(1 海南大学园艺学院，海口，570228；2 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所/海南省热带园艺产品采后生理与保鲜重点实验室，广东湛江，524091)

番木瓜CaricapapayaL.广泛种植于热带与亚热带地区[1],属于呼吸跃变型浆果，果实采后损失巨大，由胶胞炭疽菌引起的炭疽病是番木瓜采后腐烂的主要原因之一[2]。因而，减少番木瓜采后炭疽病发生，提升番木瓜商品价值是该产业发展亟待解决的问题。目前，番木瓜采后常采用传统化学药剂保鲜，而长期使用化学药剂会导致药物残留和抗病性等问题[3]。植物精油是果蔬采后贮藏保鲜的新型生物防治手段，主要通过杀菌抑菌作用直接影响采后致病菌生长，同时诱导果实增强自身抵抗能力，从而延缓果蔬采后贮藏期间成熟衰老进程。前人研究结果表明，植物精油对草莓[4]、荔枝[5]、柑桔[6]等具有较好的防腐保鲜效果。香茅精油是香茅体内的重要次生代谢产物，具有抑菌和果蔬保鲜等作用，在果蔬防腐保鲜方面具有较好的应用前景。大量研究表明，香茅精油在一定程度上可显著控制多种果蔬采后主要致病菌生长，有望替代化学合成抗菌剂用于果蔬采后保鲜。如Regnier等[7]研究发现，香茅精油750 μL/L挥发熏蒸处理4 d后能100%抑制柑桔酸腐致病菌菌丝体生长；Herath等[8]研究发现，香茅精油在较低浓度下即能完全抑制香蕉炭疽病和冠腐病致病菌；Maqbool等[9]报道了0.05%香茅精油对香蕉和番木瓜致病菌的体外抑制率分别达73.4%和71.3%。然而香茅精油熏蒸处理对番木瓜果实炭疽病的防控效果及其生理生化机制的分析研究鲜见报道，因此我们开展了此项研究，以期为番木瓜采后贮藏保鲜和产业发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

“美中红”番木瓜采摘于广东省湛江市遂溪县金龟岭农场；番木瓜胶孢炭疽菌ColletotrichumgloeosporioidesPenz.，由南亚热带作物研究所采后病理实验室分离保存；香茅精油(≥99%)，研邦化工科技有限公司产；木质素含量试剂盒、植物总酚含量试剂盒、过氧化氢(H2O2)含量试剂盒、苯丙氨酸解氨酶(PAL)试剂盒、过氧化物酶 (POD)试剂盒、多酚氧化酶(PPO)试剂盒、几丁质酶(CHI)试剂盒、β-1，3-葡聚糖酶(β-1，3-GA)试剂盒，苏州科铭生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 香茅精油熏蒸对炭疽病菌抑制效果测定 参考钟蔓茜等[10]的方法并稍加修改，设置香茅精油浓度为7.5、15、30 μL/L，挑选无病虫害、大小相对一致、无机械损伤、成熟度为2～3线黄的番木瓜果实，用0.25 g/L咪鲜胺浸泡果柄5 min，晾干后装入55 L密封箱内，箱内放1个培养皿，将滤纸固定在培养皿上，将不同浓度香茅精油滴加在滤纸上，精油不与果实接触，以不滴加精油为对照(空白)，立即密闭熏蒸，每处理果实10个，重复3次；熏蒸72 h后，将果实取出，用针刺法接种直径5 mm的胶孢炭疽菌菌块，25 ℃下培养24 h后取下菌块，装入PE保鲜袋，轻扎袋口置于25 ℃贮藏，贮藏后每2 d测量病斑直径，并计算抑制率。抑制率(%)=(对照病斑直径-处理病斑直径)/对照病斑直径×100。

1.2.2 香茅精油熏蒸对番木瓜炭疽病防效测定 香茅精油熏蒸方法同1.2.1，每处理果实15个，重复3次，熏蒸后取出果实装入PE保鲜袋，轻扎袋口置于25 ℃贮藏，贮藏后每2 d调查，番木瓜果实炭疽病病情参考陈文[11]的方法分为9个等级，计算病情指数和防治效果。病情指数=∑(病情级数×该级病果数)/(病情最高级数×果实总数) ×100，防治效果(%)=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100。

1.2.3 香茅精油熏蒸对炭疽菌菌丝生长和产孢影响测定 参考徐仕翔[12]的方法并稍加修改，设置精油浓度为7.5、15、30、50 μL/L，从培养5 d的炭疽菌落边缘打取直径5 mm菌饼，接种到灭菌马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板中央，不封盖置于已灭菌的5 L密封箱内，将滤纸固定在密闭箱内，将不同浓度香茅精油滴加在滤纸上，不滴加精油为对照(空白)，立即密闭熏蒸；熏蒸72 h后在无菌条件下取出平板，用封口膜密封后继续置于28 ℃下恒温培养，3 d后测量菌落直径，并用血球计数板计量每个培养皿的产孢量，重复3次。

1.2.4 番木瓜果实抗病相关物质含量测定 设置精油浓度为15 μL/L，不加精油为对照(空白)，番木瓜果实处理方法同1.2.1，每处理果实10个，重复3次，分别在采后第0、3、5、7、9、11天时取两个处理果实病健交界处果皮组织，取样果皮组织80 ℃烘干至恒重，粉碎，过40目筛，称取10 mg，采用试剂盒测定木质素含量，结果以mg/g DW表示。另将样本烘干至恒重，粉碎，过40目筛，称取约0.1 g，加入提取液2.5 mL，60 ℃振荡提取2 h，10 000 g，25 ℃，离心10 min，取上清，用提取液定容至2.5 mL，采用试剂盒测定总酚含量，结果以mg/g DW表示。H2O2含量也采用试剂盒测定，结果以μmol/g FW表示，所有测定均重复3次。

1.2.5 番木瓜果实抗病相关酶活性测定 番木瓜果实处理同1.2.1和取样方法同1.2.4。称取果皮约0.1 g研磨成粉末，加入提取液1 mL，10 000 g，4 ℃离心10 min后取上清液，采用PAL试剂盒测定PAL活性；以每1 g组织在每1 mL反应体系中每1 min使290 nm下吸光值变化0.1为1个酶活性单位U，结果以U/g FW表示。POD活性采用POD试剂盒测定，称取果皮约0.1 g研磨成粉末，加入提取液1 mL，8 000 g，4 ℃离心10 min，取上清液进行测定；以每1 g组织在每1 mL反应体系中每1 min使470 nm下吸光值变化0.01为1个酶活力单位U，结果以U/g FW表示。称取果皮0.1 g研磨成粉末，加入提取液1 mL，8 000 g，4 ℃离心10 min，取上清液，采用PPO试剂盒测定PPO活性；以每1 min每1 g组织在每1 mL反应体系中使525 nm处吸光值变化0.01为1个酶活力单位U，结果以U/g FW表示。称取果皮约0.1 g研磨成粉末，加入提取液1 mL，10 000 g，4 ℃离心20 min，取上清液采用CHI试剂盒测定CHI活性；以每1 g组织每1 h分解几丁质产生1 mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为1个酶活力单位U，结果以U/g FW表示。称取果皮约0.1 g研磨成粉末，加入提取液1 mL，12 000 g，4 ℃离心10 min，取上清液，采用β-1，3-GA试剂盒测定β-1，3-GA活性；以每1 g组织每1 h产生1 mg还原糖定义为1个酶活性单位U，结果以U/g FW表示。所有测定均重复3次。

1.3 数据处理

采用 Excel 2010软件整理数据并制图，采用SPSS 22.0软件进行方差分析，用Duncan’s多重比较进行数据差异显著性分析，p<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 对番木瓜炭疽病菌的抑制效果和防效

由图1和表1可以看出，在整个贮藏期间，不同浓度香茅精油处理的病斑直径明显小于对照(空白)，均有较好抑制效果，其中15 μL/L精油处理抑制效果最好，贮藏第5、7、9、11 d时的病斑直径分别为0.6、1、4、7 mm，抑制率分别为91.2%、93.2%、86.3%、84.6%。

注：不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

表1 香茅精油处理对不同贮藏时间番木瓜炭疽病菌的抑制率和防效比较

对照(空白)和7.5 μL/L精油处理在贮藏5 d时即显示症状，15 μL/L和30 μL/L处理在贮藏9 d时显示症状。整个贮藏期间，精油处理的番木瓜果实病情指数始终显著低于对照(空白)；贮藏9 d，15 μL/L和30 μL/L精油处理的病情指数分别为2.5和1.3，二者无显著性差异；贮藏11 d时，15 μL/L和30 μL/L精油处理的病情指数分别为15和20，防效分别为70%和60%，15 μL/L精油处理的防治效果明显高于30 μL/L精油处理。

2.2 对番木瓜炭疽菌菌丝生长和产孢影响

由表2和图2可以看出，不同浓度香茅精油处理番木瓜炭疽菌后3 d的菌落直径明显小于对照(空白)，7.5、15、30 μL/L香茅精油处理的菌丝抑制率分别为15.6%、36.2%、41.4%，说明香茅精油可显著抑制番木瓜炭疽菌菌丝的生长，且随着处理浓度的增大，对菌丝的抑制作用越强。香茅精油处理促进了炭疽菌产孢，其中7.5 μL/L处理产孢量最多，其他3个浓度处理的产孢量也显著高于对照(空白)。

表2 香茅精油处理对番木瓜炭疽菌菌丝生长和产孢影响(28 ℃，3 d)

图2 香茅精油处理对番木瓜炭疽菌菌丝生长的抑制效果

2.3 对番木瓜果实抗病相关物质含量的影响

由图3可以看出，在整个贮藏期间，番木瓜果实中木质素含量呈下降趋势，香茅精油处理和对照(空白)果实木质素含量从开始的132.2 mg/g DW分别下降到91.8和105.3 mg/g DW。15 μL/L处理的果实木质素含量在贮藏前期与对照(空白)差异不显著，在贮藏5～7 d快速下降且显著低于对照(空白)。

图3 香茅精油处理对番木瓜果实中木质素、总酚、H2O2含量和丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响

在贮藏期间，番木瓜果实中总酚含量呈先上升后下降趋势，精油处理对果实中总酚含量影响不大，与对照(空白)无显著性差异。贮藏7 d时，精油处理和对照(空白)果实总酚含量分别达到峰值16.1和16.5 mg/g DW。

在贮藏期间，精油处理的果实H2O2含量呈先上升后下降趋势，而对照(空白)则呈先下降后上升再下降趋势。精油处理的果实H2O2含量在整个贮藏期间均显著高于对照(空白);贮藏9 d时，精油处理和对照(空白)果实中H2O2含量分别达到峰值3.29和2.36 μmol/g FW，精油处理峰值比对照(空白)提高了39.1%。

2.4 对番木瓜果实抗病相关酶活性的影响

由图3可以看出，精油处理果实的PAL活性在整个贮藏期间显著高于对照(空白)，PAL活性在20.3～26.4 U/g FW之间波动，而对照(空白)果实PAL活性为12.1～21.8 U/g；贮藏5 d时，精油处理果实的PAL活性达到峰值，为26.4 U/g FW，比对照(空白)提高了118%。

由图4可以看出，精油处理和对照(空白)番木瓜果实的POD活性均呈先下降后上升再下降趋势。在贮藏前期，精油处理和对照(空白)果实POD活性没有显著性差异，而在贮藏中后期精油处理果实的POD活性显著低于对照(空白)。精油处理和对照(空白)果实POD活性分别在贮藏5 d和7 d时达到峰值760.3 U/g FW和928.9 U/g FW，说明精油处理提前了番木瓜果实的POD活性的高峰，且在贮藏中后期降低了POD活性。

在贮藏期间，精油处理的番木瓜果实PPO活性呈先下降后上升再下降再上升趋势，而对照(空白)则呈先下降后上升趋势，精油处理的果实PPO活性显著高于对照(空白)。贮藏5 d时，精油处理和对照(空白)的果实PPO活性分别为202.7 U/g FW和130.5 U/g FW，处理比对照(空白)提高了55.3%。贮藏11 d时，精油处理和对照(空白)果实的PPO活性都达到最大值，分别为205.2 U/g和181.9 U/g FW，处理比对照(空白)提高了12.8%。

2.5 对番木瓜果实病程相关酶活性的影响

由图4可以看出，在贮藏期间，对照(空白)和精油处理的番木瓜果实CHI活性均呈先上升后下降趋势，且均在贮藏9 d时达到峰值2.8 U/g FW。在贮藏前期精油处理在一定程度上提高番木瓜果实的CHI活性，但在贮藏中后期，精油处理和对照(空白)果实CHI活性没有显著性差异。

图4 香茅精油处理对番木瓜果实中过氧化物酶 (POD)、多酚氧化酶(PPO)、几丁质酶(CHI)和β-1，3-葡聚糖酶(β-1，3-GA)活性的影响

在贮藏期间，番木瓜果实中β-1，3-GA活性整体上呈先上升后下降趋势，且精油处理可显著提高果实β-1，3-GA活性。贮藏7 d时，精油处理和对照(空白)的β-1，3-GA活性均达到峰值，峰值分别为97.0 FW和79.5 U/g FW，处理峰值比对照(空白)提高21.9%。

3 结论与讨论

大量研究表明，香茅精油处理可显著抑制多种果蔬采后致病菌生长，诱导果实防御系统，提高抗病性，降低果实病情指数。纪淑娟等[13]研究了香茅精油对炭疽菌、蒂腐菌等多种果蔬采后病原菌的抑制效果，发现可显著抑制多种病菌菌丝生长和产孢。陈倩茹[14]研究发现香茅精油可显著抑制樱桃番茄黑腐病和灰霉病的发病率。本研究结果表明，不同浓度香茅精油处理对番木瓜炭疽病均有一定的防控作用，在贮藏过程中，15 μL/L精油处理的菌丝抑制效果明显高于30 μL/L精油处理，而15 μL/L和30 μL/L精油处理的防治效果在贮藏9 d时无显著性差异，可能的原因是抑制效果是刺伤接种，只针对番木瓜炭疽病；防治效果测定是自然发病，果实上除了炭疽病还有其他病害，精油处理的防治效果会稍有下降。

精油可通过直接抑制多种果蔬采后病原菌的菌丝体生长或生殖生长，从而影响病原菌生长总量。王丹等[15]研究了丁香精油对3种樱桃采后主要致腐真菌胶孢炭疽菌、链格孢菌和灰葡萄孢菌的影响，发现一定浓度的精油处理后真菌细胞内核酸和蛋白质物质均出现流失现象，导致真菌菌丝体生长和孢子萌发受到显著抑制。Silva等[16]研究发现，250 g/mL迷迭香精油可显著抑制黄曲霉菌丝生长；戴向荣等[17]研究发现肉桂精油的主要成分肉桂醛可通过氧化细胞质膜影响孢子细胞膜完整性，从而抑制孢子生长。而本研究结果发现，15 μL/L精油处理显著抑制了番木瓜炭疽菌菌丝的生长，但在一定程度上促进了炭疽菌产孢，这可能是精油处理给炭疽菌的生长提供一种逆境，进而促进病菌产孢；随着精油浓度的增加，菌丝生长进一步受到抑制，产孢量也随之下降。

精油处理提高果实的诱导抗病性是抑制果蔬采后腐烂的重要原因之一，果实采后诱导抗病性与抗病相关酶PAL、POD、PPO和CHI、β-1，3-GA等活性密切相关。大量研究报道表明，精油处理可显著提高果实体内抗病相关酶活性，从而诱导其防御机制，增强果实在贮藏期间的抗病能力。李宁等[18]研究发现，丁香精油显著抑制冬枣果实的腐烂与抗病相关酶PAL、PPO和POD的活性升高密切相关。石泽栋等[19]研究发现，牛至精油可提高杏果实体内POD、PAL、CHI和β-1，3-GA活性，从而降低杏果实采后贮藏期间的腐烂率。魏彦珍等[20]研究发现，茶树精油处理可显著提高草莓果实体内的PPO和PAL活性，但对β-1，3-GA活性几乎无影响。本研究发现，香茅精油处理可显著提高番木瓜果实中PAL、PPO和β-1，3-GA活性，尤其在贮藏5 d时PAL、PPO活性出现明显的峰值，明显延缓了PAL活性的下降，精油处理对CHI活性影响不大，在贮藏后期反而抑制了POD活性。

木质素和总酚是重要的抗病相关物质，郭欣等[21]研究了西番莲果实采后病害与木质素和总酚含量的关系，发现西番莲果实抗病性的下降与其果皮中木质素和总酚含量密切相关。李宁等[18]研究发现，0.5%和0.3%丁香精油处理可显著增加冬枣果实中总酚类物质的含量，从而提高其诱导抗病性。与本研究结果不一致，本研究结果表明，香茅精油处理对番木瓜果实中总酚含量几乎无影响。孟金明等[22]研究发现，木姜子精油处理浓度与枇杷果实中木质素含量呈显著负相关，适宜的精油处理可有效降低果实中木质素含量，与本研究结果相似。本研究结果表明，香茅精油处理对番木瓜果实贮藏前期木质素含量几乎无影响，而贮藏后期显著降低了果实中木质素含量。

活性氧自由基暴发是植物快速防御反应之一，H2O2作为典型的活性氧自由基，可直接抑制病原菌孢子萌发甚至杀死病原菌[23]。另外，H2O2可作为植物防御反应的第二信使参与影响植物生理代谢，进而激活和调控植物体内各种胁迫相关基因，并影响蛋白如各种抗病相关物质的表达翻译[24]。谷会等[25]研究氯化钙处理可显著提高菠萝果实贮藏后期的H2O2含量，进而影响病程蛋白CHI和β-1，3-GA活性的表达翻译。本研究也得出类似结论，香茅精油处理显著提高了H2O2含量和β-1，3-GA活性，一方面H2O2作为抗病物质提高番木瓜果实抗病性；另一方面，提高的H2O2可能作为信号物质调控β-1，3-GA的表达翻译。

总之，不同浓度香茅精油熏蒸处理对番木瓜炭疽病具有较好抑制作用和防治效果，其中15 μL/L精油熏蒸处理防治效果最好。香茅精油处理明显抑制了番木瓜炭疽菌菌丝的生长，明显提高了番木瓜果实中H2O2含量及抗病相关酶PAL、PPO和β-1，3-GA活性。推测香茅精油熏蒸处理对番木瓜采后炭疽病防控的生理生化机制一方面是由于直接抑制病原菌菌丝生长，降低其致病性；另一方面是提高番木瓜果实抗病相关物质含量和抗病相关酶活性，从而诱导果实产生抗病性。