一种曲霉的鉴定及其对亚洲柑桔木虱的毒力评价

余金珂，娄兵海，阳廷密，宋雅琴，李怡杰，豆 威，王进军

(1 广西柑桔育种与栽培工程技术研究中心/广西特色作物研究院，广西桂林，541004； 2 重庆市潼南区农业农村委员会，重庆，402660；3 西南大学植物保护学院，重庆，400715)

亚洲柑桔木虱Diaphorinacitri(以下简称柑桔木虱)属半翅目Hemiptera，木虱科Psyllidae，不仅会吸食柑桔汁液和分泌蜜露造成煤污病，还能传播柑桔黄龙病。因其体型小，繁殖能力快，世代重叠严重，以及生产中不合理施药，柑桔木虱的抗药性迅速增加[1]。生防真菌不易诱导害虫产生抗性，且广泛存在于自然界中，可安全、环保地防治害虫[2]。现已报道柑桔木虱的病原真菌，包括玫烟色拟青霉Isaria(Paecilomyces)fumosorosea、蜡蚧轮枝菌Lecanicilliumlecanii[3-7]、球孢白僵菌Beauveriabassiana、檬形被毛孢Hirsutellacitriformis[8-9]和绿僵菌Metarhiziumanisopliae等[10]，暂无棘孢曲霉Aspergillusaculeatus防治柑桔木虱的报道。本研究在田间死亡的柑桔木虱僵虫上分离获得1株曲霉，经鉴定为棘孢曲霉，并对其生防效果进行了测定，研究结果可为柑桔木虱的生物防治提供更多的选择。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株与昆虫：菌株来源于笔者在桂林市阳朔县田间发现的僵死柑桔木虱成虫，经分离纯化后，初步鉴定其为一种曲霉，命名为曲霉YS-1。试验所用曲霉YS-1均经接种柑桔木虱复壮保存所得。供试昆虫为柑桔木虱成虫，全部采自桂林市雁山区附近失管柑桔园。

主要试剂：PDA培养基DifcoTM，美国BD公司；真菌基因组DNA快速提取试剂盒，北京华越洋生物科技有限公司；QIAquick Gel Extraction Kit，QIAGEN公司；TaKaRaTaqHot Start Version Kit，TaKaRa公司；引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)由上海生工生物工程股份有限公司合成。

主要仪器：常规PCR仪T100TMThermal Cycler，Bio-Rad 公司；超景深三维显微镜系统，日本基恩士；喷雾塔SOP-E-027，BURKARD POTTER；人工气候箱RXZ-280B-LED，宁波江南仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 分生孢子液的制备 曲霉YS-1复壮后，用无菌刮孢器把分生孢子从PDA培养基上刮下，在4 ℃冷藏备用。使用前先溶于0.05%吐温-80中，再用磁力搅拌器搅拌30 min后过滤，制成分生孢子母液。母液浓度用血球计数板确定。试验所用孢子溶液均由母液经0.05%吐温-80逐级稀释获得。每次使用前取5 μL分生孢子母液滴入PDA培养基，放置于培养箱[温度(26±1)℃，相对湿度(80±5)%，光照L12∶D12]中12 h后，用显微镜检测孢子萌发情况。每次检测100个孢子，芽管明显可见的视为萌发。重复3次。试验所用孢子的萌发率均高于90%。

1.2.2 科赫法则检测 将柑桔木虱置于-20 ℃冷冻2 min后放置于装有冰块的培养皿上，用喷雾塔(0.2 bar，1 mL)将孢子浓度为1×107个/mL的分生孢子液喷洒于试虫体表。处理后的试虫放置于装有新鲜柑桔叶的一次性塑料杯中，并放入恒温培养箱[温度(26 ± 1)℃，相对湿度(80 ± 5)%，光照L12∶D12]。处理和对照每组所用试虫数均为30头。将死亡试虫放入装有湿润滤纸的无菌培养皿内保湿培养5～8 d，培养温度为(26 ±1)℃，用超景深显微镜观察死虫菌丝孢子生长情况，并将试虫身上长出的菌丝孢子分离纯化后进行形态学观察。用上述在死虫上分离的真菌以同样的方法再次接种柑桔木虱，记录僵虫菌丝与孢子生长情况，再次在PDA培养基上分离纯化后观察菌的形态。

1.2.3 真菌鉴定 宏观形态学观察：在超净工作台中，将曲霉YS-1的分生孢子以单点的形式接种到PDA培养基上，放置在(25 ± 1)℃培养箱中5 d后观察，并拍照记录。

微观形态学观察：取少量菌丝置于装有0.05%吐温-80的1.5 mL离心管中，利用涡旋仪振动洗脱孢子梗上的孢子。取洗脱后的菌丝和孢子于载玻片上制片，用超景深三维显微镜系统镜检记录。

rDNA-ITS序列分析：取0.5 g菌丝，液氮处理研磨后，用真菌基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA，并用真菌核糖体DNA区域通用引物ITS1和ITS4对提取的DNA进行扩增。PCR反应体系为25 μL：ddH2O 17.4 μL，10 × PCR Buffer 2.5 μL，5 U/μL热启动TaqDNA聚合酶0.1 μL，2.5 mmol/L dNTP mixture 2 μL，5 μmol/L ITS1 1 μL，5 μmol/L ITS4 1 μL，DNA模板1 μL。PCR扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。扩增产物经QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒纯化回收后，送上海生工生物工程有限公司测序。测序结果进行在线Nucleotide BLAST比对，并利用MEGA5.0邻接法构建系统进化树。

1.2.4 毒力测定 将制备好的分生孢子母液稀释为1×107、5×106、1×106、5×105和1×105个/mL共5个浓度，孢子液喷洒于柑桔木虱体表，然后将其饲养于装有新鲜柑桔叶的一次性塑料杯中，并放置于恒温培养箱[温度(26±1)℃，相对湿度(80±5)%，光照L12∶D12]。处理和对照每组所用的试虫均为25头。每隔12 h记录一次死虫数，连续记录5 d，最后记录存活虫数。调查结束后将死虫挑出，放在有湿滤纸的培养皿中保湿保存，8 d后观察记录僵虫数。每个处理设3次重复，以0.05%吐温-80溶液为对照。

试验数据用SPSS 22.0软件的Probit处理，将浓度转化为对数值，以x表示；将死亡率转化为概率值，以y表示，求出截距a和斜率b，得出毒力回归方程。用僵虫数除以处理中的死虫总数得到僵虫率。

2 结果与分析

2.1 科赫法则验证

利用喷雾法将曲霉YS-1接种于健康柑桔木虱成虫上，待试虫死后将其放在含湿润滤纸的无菌培养皿中，(26±1) ℃培养5～8 d后，虫体长出菌丝和孢子(见图1)。对试虫尸体上长出的菌物再分离纯化，并制成分生孢子悬浮液对健康试虫喷雾处理，待试虫死亡，死虫经保湿处理后，长出相似真菌，经过分离纯化得到与曲霉YS-1形态一致的真菌。上述结果表明，曲霉YS-1为柑桔木虱的病原真菌。

图1 柑桔木虱被曲霉YS-1侵染后形成的僵虫

2.2 分子鉴定与形态观察

将扩增测序获得的曲霉YS-1 ITS序列进行在线Nucleotide BLAST比对的结果表明，YS-1与棘孢曲霉A.aculeatus及该种真菌的多个分离株序列相似性达99%～100%。针对已知曲霉属中虫生真菌相关种[11-14]和曲霉YS-1的同源模式菌，进行系统发育分析的结果表明，A.aculeatus(NR111412.1)与曲霉YS-1聚在同一分支上，且同源性达100%(见图2)。

注：采用邻接法(NJ)构建进化树，每个菌株后面编号为其在基因库中的登录号。

形态学观察发现，在26 ℃下，曲霉YS-1在PDA培养基培养5 d后，具同心圆环，菌丝为白色，分生孢子为棕褐色，质地丝绒状(见图3 A)。通过超景深三维显微镜观察发现，分生孢子为球形，分生孢子柱头为球形辐射状(图3 B和C)。上述形态特征符合棘孢曲霉的形态学描述[15]。因此，结合分子鉴定及形态学观察结果，确认该真菌为棘孢曲霉，命名为棘孢曲霉YS-1。

注：A为形态菌落，B、C为超景深显微镜视野下的分生孢子。

2.3 曲霉YS-1对柑桔木虱的毒力测定

试验结果看出，随着曲霉YS-1分生孢子浓度增加，试虫死亡率逐渐增加(见图4)。

图4 不同浓度曲霉YS-1分生孢子液处理下柑桔木虱死亡率的变化

曲霉YS-1处理试虫5 d的毒力回归方程及相关系数(见表1)，LC50为3.017×106个/mL。1×107个/mL曲霉YS-1孢子悬浮液处理试虫，5 d后的校正死亡率为71.4%。在所有的死虫中，僵虫率为88.1%。

表1 曲霉YS-1对柑桔木虱的毒力(5 d)

3 讨论

柑桔木虱可传播柑桔黄龙病菌，严重威胁柑桔产业的健康可持续发展。随着柑桔木虱的抗药性增加以及农药减量政策的推进，加强生防真菌资源的挖掘十分重要。生防真菌的种类多样，其中，曲霉属Aspergillus虫生真菌种类有黄曲霉A.flavus、寄生曲霉A.parasiticus、米曲霉A.oryzae、溜曲霉A.tamarii、棕曲霉A.ochraceus、黑曲霉A.niger和亮白曲霉A.candidus[15]。此外，有研究者从田间柑桔木虱虫体上分离得到日本曲霉A.japonica和韦斯特迪克氏曲霉A.westerdijkiae，其中，韦斯特迪克氏曲霉具有高致病性[12，13]。本研究结果显示，从田间柑桔木虱僵虫上分离纯化出的真菌是棘孢曲霉A.aculeatus，且为柑桔木虱的病原真菌。由于棘孢曲霉对柑桔木虱具有较强的毒力，因此有望成为一种新型杀虫真菌。棘孢曲霉常存在于土壤中，未被报道用于害虫防治，因此在实际田间应用前，需要试验验证其在田间的实际防效，同时应评估该类真菌是否会产生对人畜有害的物质，以及其对环境和生态是否有负面影响。