云斑白条天牛COI基因碱基序列长度与基因差异相关性比较

常志恒 梅增霞 李建庆 张 颖

（滨州学院生物与环境工程学院，山东滨州 256603）

云斑白条天牛为鞘翅目天牛科昆虫，是我国重要的园林蛀干害虫，在我国分布广泛，危害寄主众多，对很多园林树木造成严重危害。据项目组调查，云斑白条天牛对黄河三角洲地区的白蜡树和洞庭湖地区的杨树造成的危害尤其严重[1-2]。因此，深入开展云斑白条天牛的遗传分化机制研究，对掌握云斑白条天牛的生态习性和开展综合防治具有重要意义。

线粒体基因具有分子量小、保守性好等特点，是研究昆虫进化和遗传多样性的理想材料，线粒体DNA中应用最普遍的是细胞色素C氧化酶亚基I（COI）[3-4]。开展昆虫线粒体基因遗传多样性研究过程中，提取、扩增获得目的基因后，在DNA序列拼接输出时，普遍面临的问题是同一基因不同样品获得的碱基序列长度不一致。在进行遗传分析时，是否必要将同一基因的碱基序列剪切为长度一致，这是在开展线粒体遗传分析时需要解决的一个基础问题。

本文以云斑白条天牛COI基因为例，分别提取、扩增了2014年和2019年为害白蜡树和杨树的云斑白条天牛雌、雄成虫的COI基因，分析云斑白条天牛COI基因碱基序列长度与基因相关性，以确定在进行线粒体基因遗传分析时是否必要将待分析基因的长度统一，为以后开展相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

为害白蜡树云斑白条天牛雌、雄成虫于2014年6月和2019年6月在山东滨州城区采集；为害杨树云斑白条天牛雌、雄成虫于2014年6月在湖南岳阳、2019年5月在湖南沅江采集。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取、扩增与测序。利用动物基因组DNA提取试剂盒，提取云斑白条天牛总DNA。采用昆虫线粒体COI基因通用引物，利用PCR试剂盒，扩增获得COI基因，由生工生物（上海）股份有限公司完成测序。

1.2.2 DNA序列的拼接和剪切。利用DNAStar软件完成COI基因的序列拼接和剪切，以及碱基含量分析和相似度比较。

通过DNAStar的SeqMan程序双向拼接，不剪切，输出获得不同样品的COI序列，称为初始序列。将COI初始序列，根据MagAlign的比对结果，通过Edit Seq程序将初始序列两端剪切一定数量的碱基，将不同样品的COI基因碱基序列长度统一为640 bp，称为剪切序列。

1.2.3 COI基因序列长度与基因差异相关性比较。利用初始序列，分别比较2014年和2019年为害白蜡树和杨树云斑白条天牛雌、雄成虫的COI基因序列差异；利用剪切序列，分别比较2014年和2019年为害白蜡树和杨树云斑白条天牛雌、雄成虫的COI基因序列差异。

将初始序列和剪切序列获得基因差异结果进行比较，统计分析不同样品COI基因序列长度在分析比较碱基差异时的必要性。

2 结果与分析

2.1 COI基因的初始序列碱基含量分析

由表1可以看出，为害白蜡树云斑白条天牛雌、雄成虫的COI基因的初始序列长度在699～709 bp之间，平均为705 bp，2014年和2019年雌、雄成虫碱基A+T含量均在65%以上，2014年雌成虫4个碱基的含量顺序由高到低为A＞T＞G＞C，2019年雌成虫、2014年雄成虫和2019年雄成虫均为T＞A＞C＞G。为害杨树雌、雄成虫的COI基因的初始序列长度在663～713 bp之间，平均为699 bp，2014年和2019年雌、雄成虫碱基A+T含量均在64%以上，2014年和2019年雌成虫4个碱基的含量顺序由高到低均为T＞A＞C＞G，2014 年雄成虫为 A＞T＞G＞C，2019 年雄成虫为 T＞A＞C＞G。

表1 云斑白条天牛成虫COI基因初始序列碱基含量比较

2.2 COI基因剪切序列的碱基含量分析

将云斑白条天牛COI基因的初始序列剪切为640 bp，剪切序列的碱基含量见表2。可以看出，为害白蜡树云斑白条天牛2014年和2019年雌、雄成虫碱基A+T含量均在65%以上，2014年和2019年雌、雄成虫4个碱基的含量顺序均与初始序列的碱基含量分析结果一致。为害杨树云斑白条天牛2014年和2019年雌、雄成虫碱基A+T含量均在64%以上，2014年和2019年雌、雄成虫的4个碱基的含量顺序均与初始序列的碱基含量分析结果一致。

表2 云斑白条天牛成虫COI基因剪切序列碱基含量比较

2.3 不同样品COI基因初始序列相似度比较

由表3可知，为害杨树云斑白条天牛雌成虫在2014年和2019年之间相似度最高，为98.0%；其次是为害白蜡树雌成虫；再次是为害白蜡树雄成虫；为害杨树雄成虫相似度最小，为97.0%。针对同一寄主的雌、雄成虫，为害白蜡树雌成虫在2014年和2019年之间相似度（97.9%）大于雄成虫（97.6%），为害杨树雌成虫相似度（98.0%）大于雄成虫（97.0%）。

表3 云斑白条天牛COI基因初始序列的碱基相似性比较

2.4 不同样品COI基因剪切序列相似度比较

将初始序列剪切为640 bp，按相同方法分析比较2014年和2019年为害白蜡树和杨树云斑白条天牛雌、雄成虫COI基因序列的相似度，结果见表4。可以看出，为害白蜡树和杨树云斑白条天牛的雌、雄成虫的COI基因在2014年和2019年之间相似度均大于用初始序列分析获得的相似度，增加最多的是为害杨树雄成虫，增加了1.9个百分点；增加最小的是杨树雌成虫，增加了1.5个百分点。序列剪切统一长度后相似度增加的主要原因是剪掉了序列开始和末端的一些不一致碱基。

表4 云斑白条天牛COI基因剪切序列的碱基相似性比较

2.5 COI基因初始序列与剪切序列相似度比较

从图1可以看出，利用剪切序列分析2014年和2019年为害白蜡树和杨树云斑白条天牛雌、雄成虫的COI基因相似度与利用初始序列分析获得的结果基本一致，2014年和2019年之间相似度由大到小依次是为害杨树雌成虫、为害白蜡树雌成虫、为害白蜡树雄成虫、为害杨树雄成虫，略有不同之处在于为害杨树和为害白蜡树雌成虫由大于变成了相等；为害白蜡树和杨树云斑白条天牛雌成虫相似度大于雄成虫，为害白蜡树种群雌、雄虫的平均相似度大于杨树种群。

3 结论与讨论

在开展云斑白条天牛COI基因研究时，发现不同文献和不同样本COI基因序列长度不一致。禹海鑫等[4-5]分析白条天牛属10种天牛共12个样品的线粒体COI基因的碱基序列时，将12个样品的COI基因序列长度统一剪切为434 bp。陆鹏飞等[6]分析栗瘿蜂（Dryocosmus kuriphilus）的11个不同寄主种群COI基因遗传多态性时，将11个样品序列长度统一为660 bp。本研究拼接的云斑白条天牛COI初始序列长度在663～713 bp之间，剪切序列统一长度640 bp，相同样品委托他人检测所得序列长度为658 bp。再根据COI基因的DNA电泳检测的Marker标记，笔者认为COI基因的碱基序列在600～700 bp之间应该都是合适的。

根据本研究利用同一样品的初始序列和剪切序列，分别分析了2014年和2019年为害白蜡树和杨树云斑白条天牛雌、雄成虫碱基序列的碱基含量和相似度，发现序列长度变短后，碱基含量变化较小；序列相似度变大，但不同样品之间相似度差异规律没有发生变化。因此，笔者认为，COI基因碱基序列长度统一剪短后，碱基含量及序列相似度都会发生改变，但变化的幅度不大，对定性分析的结果影响不大。因此，是否需要将碱基序列统一长度，研究者可根据自己的研究需要自行判断。