基于网络药理学与分子对接技术探究水陆二仙丹治疗糖尿病肾病的作用机制

桂厚山，叶路芬，陈昕，马浩

糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）是糖尿病长期微血管病变常见的合并症之一，是由糖尿病导致的慢性肾脏病，DN已经成为很多国家终末期肾脏病的首要病因［1］.由于我国人口老龄化严重，糖尿病发病率居高不下，DN患者数量呈上升趋势［2］.现代研究发现，DN的发生机制与炎症反应、Toll样受体等有关，受TGF-beta、Wnt、PI3K/Akt等多种信号通路的调控［3-4］.

目前，临床上对于DN患者使用中医治疗能达到显著的治疗效果.“消渴”“肾消”“尿浊”等中医学描述与DN患者的临床表现极为相似.水陆二仙丹（SLEP）出自《洪氏集验方》，由芡实末（Euryale ferox Salisb.ex Konig et Sims）、金樱子（Rosa Laevigata Michx）制为小丸，并用盐汤送服，有益肾滋阴、收敛固摄之功.有研究发现，对163例DN早期患者使用SLEP治疗4周后患者的临床症状和尿白蛋白、肾功能等指标均有改善［5］.本研究通过系统网络药理学方法探究SLEP治疗DN的有效成分、关键靶点、信号通路以及分子对接验证，以期为SLEP治疗DN具体分子机制探究，以及临床合理用药提供理论依据.

1 方法

1.1 资料与流程

本研究的具体操作流程如图1所示.

图1 流程图

1.2 SLEP有效成分筛选及靶点预测

根据2020版《中国药典》的药物规范名称，当SLEP由金樱子、芡实两味中药组成，通过TCMSP数据库检索金樱子和芡实，设置“OB≥30%，DL≥0.18”，获取并整理活性成分及靶点.结合PubMed文献数据库查询相关文献，最终得到SLEP有效成分数据.将上述靶点利用Uniprot数据库进行标准化处理.文章使用数据库如表1所示.

表1 本研究使用的数据库及分析平台

1.3 DN疾病靶点的获取以及SLEP潜在作用靶点的预测

以“diabetic kidney disease”“diabetic nephropathy”为检索词，筛选GeneCards数据库、CTD数据库、DisGeNET数据库得到DN疾病靶点.利用微生信云平台绘制SLEP靶点与DN基因靶点之间的Venn图，得到交集靶点.

1.4 SLEP的网络调控和核心靶点的获取

在获得SLEP的有效成分靶点与DN疾病靶点的交集靶点的基础上，利用Cytoscape 3.7.1构建SLEP的网络模型，在String数据库中将交集靶点带入，构建“SLEP-DN”治疗靶点相互作用（PPI）网络，以“种属人、互作分数值为0.4”为筛选标准.计算各靶点间Degree值，Betweenness centrality值、Closeness centrality值，取三者平均值之上的靶点作为核心治疗靶点.

1.5 GO富集分析和KEGG信号通路分析

将核心靶点导入DAVID数据库，选择物种为“Homo sapiens”，进行GO富集分析和KEGG信号通路分析.本研究中GO富集分析以“FDR＜0.01”为筛选条件，使用python的seaborn包进行绘制并以气泡图形式输出.KEGG信号通路分析的结果将在微生信在线作图软件中以气泡图形式输出.

1.6 分子对接分析

将得到的关键化合物与关键靶点进行分子对接验证，从PDB数据库下载关键靶点的结构，在PyMOL软件中去除靶蛋白中的配体和非蛋白分子.从PubChem数据库中下载筛选出的关键成分3D结构，利用PyMOL软件对其进行处理，最后运用AutoDock vina软件进行分子对接，使用PyMOL软件对结果进行可视化，将对接良好的分子带入ProteinsPlus平台导出2D结构图.

2 结果

2.1 SLEP有效成分筛选及靶点预测

通过TCMSP数据库的筛选得到SLEP两味药物有槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等9种活性化合物成分（表2），其主要对应靶点193个.通过检索GeneCards数据库、DisGeNET数据库、CTD数据库，检出与DN相关的靶点分别为3 379个、1 189个、19 264个，通过Venn图获得SLEP与DN疾病共有85个交集靶点（图2），由此可筛选得到SLEP治疗DN的交集靶点85个，随后通过Cytoscape 3.7.1软件绘制“化合物-靶点-疾病”中药网络调控图，详见图3.

表2 SLEP有效成分

图2 药物与疾病的Venn图

图3 化合物-靶点-疾病调控网络图

2.2 核心靶点筛选及PPI网络构建结果

在String数据库中得到的85个交集靶点，限定参数（BC≥0.007 367，CC≥0.635，Degree≥34）拓扑筛选后获得27个核心靶点，使用Cytoscape 3.7.1软件绘制PPI网络图，见图4.最终筛选得到SLEP治疗DN的核心靶点27个，分别为

图4 SLEP治疗DN的核心靶点PPI网络图

AKT1、IL-6、TNF、VEGFA、ALB、TP53、MAPK1、CASP3、MAPK8、PTGS2、MMP9、JUN、CXCL8、EGFR、CCL2、EGF、IL1B、MMP2、NOS3、PPARG、SERPINE1、HMOX1、RELA、MPO、PTEN、STAT1、CAV1.

2.3 关键靶点的GO富集分析和KEGG信号通路分析

结果显示，共有GO条目251个，其中生物过程（BP）条目134个、分子功能（MF）条目84个、细胞组成（CC）条目43个（图5）.BP主要涉及细胞对脂多糖的反应、细胞对缺氧的反应、血管形成、血管收缩的正向调节等过程；MF主要涉及相同蛋白质结合、酶结合等方面；CC主要涉及细胞外间隙、胞外区等方面.

图5 GO功能富集分析气泡图

SLEP对治疗DN共涉及92条通路KEGG通路富集结果（图6和图7）.结果显示，SLEP治疗DN的通路主要涉及TNF、FoXO、MAPK、PI3K/Akt、NOD样受体等信号通路.

图6 KEGG通路富集分析气泡图

图7 靶点-KEGG通路-疾病图

2.4 分子对接

本研究选取交集靶点PPI网络中度值排名前五的蛋白（AKT1、ALB、IL-6、TNF、VEGFA）、排名前三的活性化合物（山奈酚、槲皮素、β-谷甾醇）与上述关键靶点进行分子对接验证.核心靶点蛋白基本信息（表3），核心化合物和核心靶点对接得分热图（图8），具有良好的结合活性（图9）.结果表明，通过筛选得到的核心化合物和关键靶点具有较好的结合活性.

表3 核心靶点蛋白基本信息

图8 SLEP核心化合物和核心靶点对接得分热图

图9 核心活性成分与核心靶点的分子对接图

3 讨论

本次研究主要涉及3个核心成分（山奈酚、槲皮素和β-谷甾醇）.槲皮素是黄酮类化合物之一，对肿瘤、病毒的增殖有一定的抑制作用，并且对心血管疾病和肾脏疾病等也有一定的治疗作用.LEI等［17］研究发现，槲皮素治疗8周可延缓小鼠肾小球系膜细胞增殖，减轻肾功能损伤，并在16周时激活db/db小鼠肾皮质Hippo通路，槲皮素能有效抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖.JIANG等［18］研究表明，槲皮素可以降低糖尿病小鼠的血尿素氮、血糖、甘油三酯等生物指标，还可以改善小鼠的蛋白尿，但是对小鼠的高密度脂蛋白胆固醇无明显影响.此外，LDLR、HMGCR、SREBP-2和SCAP的表达明显下调，可减轻db/db小鼠肾脏脂质谱的改变和脂滴的积累，从而减轻db/db小鼠的肾脏损伤.山奈酚是一种天然的多黄酮醇，作为抗糖尿病药物受到广泛关注.有研究发现［19］，山奈酚通过促进GLP-1、胰岛素的释放和抑制RhoA/Rho激酶改善肾损伤和纤维化.β-谷甾醇可以降低胆固醇和防治心脑血管疾病.BABU等［20］实验发现β-谷甾醇与受体后胰岛素信号分子β-arrestin-2、c-Src和IRS-1以及Akt蛋白具有高亲和力，能够减弱胰岛素抵抗，减轻高脂饮食诱发脂肪组织损伤.

通过对27个预测治疗靶点构建PPI网络，通过计算其拓扑学参数，获得4个关键基因，别是AKT1、IL-6、TNF、VEGFA.AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，能够调节胰岛素代谢.研究表明［21-22］，AKT1是PI3K/Akt通路的重要因子，PI3K/Akt细胞信号通路在调节葡萄糖稳态、脂质代谢、蛋白质合成以及细胞存活等方面起到了重要作用，且胰岛素能够通过PI3K/Akt信号通路调节胰岛B细胞功能.TNF-α、IL-6是脂肪细胞分泌的炎性细胞因子，能够参与能量代谢、脂质代谢等，在生殖系统和心血管等方面起到重要作用［23］.高血糖可以通过诱导氧化应激反应来促进内皮细胞的损伤，从而改善微血管的通透性，通过促进TNF-α、IL-6等的分泌来加剧炎症反应［24］.有实验证明，VEGFA可以增加内皮细胞的增殖和分化，诱导血管扩张、改善血管的通透性，在肾脏发育中起着重要作用，与糖尿病肾病密切相关［25］.

信号通路富集分析结果显示：SLEP治疗DN的通路有TNF、FoxO、MAPK、PI3K/Akt、NOD样受体等信号通路.TNF信号通路中的TNF-α能诱导炎症的发生，且含量与DN的损伤程度呈正相关，在早期高血糖、脂代谢紊乱及胰岛素抵抗均发生微炎症的产生［26］.FoxO主要通过生长因子信号等来调控细胞的凋亡、增殖和氧化应激等，FoxO信号通路为研究DN机制提供科学依据［27］.MAPK信号通路由细胞外信号相关激酶如ERK、JUN等调控MAPK，涉及多种细胞功能，包括细胞增殖、分化和迁移［28］.PI3K/Akt信号通路参与细胞生长、凋亡等过程，是胰岛素的主要下游分子通路，胰岛素抵抗2型糖尿病发生的基本机制都与该通路异常有关［29-30］，糖尿病状态下会使PI3K/Akt通路受到抑制，功能下调导致糖尿病大鼠肾小管凋亡［31］，PI3K/Akt信号通路能通过调控肾 组 织 中AQP-1的 表 达 能 改 善DN症 状［32］.NOD样受体通路是重要的信号通路之一，具有激活免疫的作用［33］，在接收到刺激后会通过信号传递的方式引发机体的炎性反应，增加炎性细胞的浸润和炎症因子的表达，从而使得该通路对启动和调节免疫系统有着重要的作用［34］.

4 结语

运用网络药理学以及分子对接技术阐述SLEP治疗DN的潜在作用机制，其中槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等化合物可能通过IL-6、TNF、VEGFA等靶点及TNF、FoxO、PI3K/Akt等信号通路发挥抗炎、免疫调节等多种功效，用以改善糖尿病肾病.由于生物信息数据库依旧有待完善，通过网络药理学分析结果可能存在部分偏倚，仍需后续进行基础研究用以佐证.