基于网络药理学和分子对接技术探讨五神汤治疗丹毒的作用机制

王彬，武亭宇，王博龙

丹毒俗称“流火”，是由A族B型链球菌引起的皮肤及皮下组织急性炎症，常表现为分界清晰的局限性红肿热痛，好发于颜面及下肢［1］.宋代陈言《三因极一病证方论》载“丹毒之病，由心实热也.心生血，主于脉，血热肌浮，阴滞于阳，即发丹毒”［2］.目前，临床上治疗丹毒常用青霉素类或头孢类抗生素，虽然效果较为显著，但在夏季易复发，且用药疗程较长，易产生耐药性和菌群失调，导致出现腹痛腹泻、免疫功能紊乱等相应症状，给患者带来了很大的心理压力和经济负担［3-4］.

陈世铎在《洞天奥旨·骨痈》云：“内用五神汤……利其湿热而又不耗其气血.”五神汤中牛膝、车前子利水消肿，茯苓淡渗而安神，紫花地丁、金银花功擅清热解毒.尤其是车前子甘寒性降、甘而滑利、寒而清热、性专降泄，以防丹毒传变；与金银花相伍，增强金银花解毒清热之力；与茯苓相配，上下相合，交通心肾，开全身之腠理，解丹毒之湿热；与牛膝同用，利水消肿兼能温肾化气，防诸药寒凉太过而伤正是为使药，牛膝又性善“引诸药下行”，亦能导丹毒之热下泄，引瘀血下行，以降“上亢之阳、上 炎 之火、上 逆 之血”［5］.此五 药相合，清热解毒与利水消肿并举［6］，而研究表明清热解毒法具有良好的抗菌功能［7］，可有效治疗丹毒，为五神汤治疗丹毒奠定了基础.

由于中药及其复方成分复杂，治疗疾病的作用机制不明确，因此运用网络药理学将药物作用网络与生物网络整合在一起，分析药物在此网络中与特定节点或模块的相互作用关系，从而解析药物和机体相互作用的科学机理［8］，有助于从整体观角度认识药物与疾病间的相互作用［9］.本文运用网络药理学探讨五神汤治疗丹毒的作用机制，以期为五神汤治疗丹毒提供理论支持.

1 材料与方法

1.1 五神汤活性成分及靶点筛选

本研究以五神汤组方中药为研究对象，在TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）数据库 中，以“金 银 花”“紫 花 地 丁”“茯 苓”“车 前子”“牛膝”为关键词，按照OB≥30%、DL≥0.18筛选其活性成分及作用的靶蛋白，再运用UniProt数据库（http：//www.uniprot.org/）将靶蛋白统一转换为基因名称保存；利用Chemical-Book数据库（https：//www.chemicalbook.com/ProductIndex.aspx）查找活性成分结构式，保存.mol格式文件后导入Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch）数据库中，利用结构相似性预测靶点，将以上两个来源的靶基因合并，构建五神汤靶基因汇总.

1.2 丹毒靶点集合构建

以“erysipelas”“inflammatory disease with redness of skin”为关键词，在GeneCards（https：//www.genecards.org）数据库中收集汇总丹毒相关靶点，筛除重复后合并，构建丹毒靶点集合.

1.3 PPI网络构建和核心靶点筛选

将筛选的五神汤靶点与丹毒靶点通过微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）取交集得到共同靶点，再将共同靶点上传至STRING平台（https：//string/db.org/），构建共同靶点PPI网络，选择“Multiple Proteins”模式，蛋白种属设为“Home Sapiens”，设置最小互作需求得分（Minimum Required Interaction Score）为0.700，其他参数保持默认，构建PPI网络模型.然后将所得文件导入Cytoscape 3.7.2，利用插件CytoNCA计算每个节点的打分，计算PPI网络的3个拓扑参数，即自由度（Degree）、介度中心性（Betweenness Centrality，BC）、接近中心性（Closeness Centrality，CC）.筛选标准：①DC值大于所有节点DC值中位数2倍的重要节点；②其他2个指标大于所有节点中位数的节点，即得到核心靶点.

1.4 GO功能分析和KEGG通路富集

将核心靶点导入DAVID平台（https：//david.ncifcrf.gov）进行GO功能分析与KEGG通路富集，物种与背景设置均为“Homo sapiens”（智人），获得GO功能分析及KEGG通路富集结果（P＜0.05），再通过微生信平台对GO功能分析和KEGG通路富集进行可视化.

1.5 关键成分-核心靶点的分子对接验证

为验证筛选出的五神汤治疗丹毒核心靶点的准确性，将关键成分与核心靶点进行分子对接.在PDB蛋白数据库（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）下载核心靶蛋白结构；在PubChem数据 库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载关键成分的结构，使用Autodock Vina软件进行分子对接.

2 结果

2.1 五神汤-丹毒核心靶点的获取

通过TCMSP数据库和Swiss Target Prediction平台筛选收集五神汤中5味药材的活性成分及作用靶点，筛选得到五神汤活性成分共21种，如表1所示，作用靶点共1 262个，删除重复值后得到301个靶点；通过GeneCards数据库获取疾病靶点992个，两者取交集得到89个共同靶点.

表1 活性成分基本信息

2.2 五神汤-丹毒靶点PPI网络的构建

将89个共同靶点上传STRING平台，将结果保存为.tsv格式，再导入Cytoscape 3.7.2软件构建五神汤-丹毒靶点PPI网络，见图1.再运用其“Network Analysis”插件进行拓扑分析筛选核心靶点，筛选策略见图2，筛得核心靶点21个.

图1 五神汤-丹毒靶点PPI网络

图2 核心靶点的筛选策略图

2.3 “活性成分-核心靶点”网络分析

利用Cytoscape 3.7.2软件构建如图3所示“活性成分-核心靶点”网络图.该图包括42个节点和93条边，节点（Node）代表有效活性成分或靶点、边（Edge）代表节点间的相互关系.Degree较高的化合物分别是槲皮素、木犀草素、山柰酚、黄芩素、β-胡萝卜素等，将度值最高的槲皮素定义为关键成分；Degree较高的靶点 分 别 是PTGS2、ESR1、NOS3、AKT1、TNF、VEGFA.本研究通过自由度（Degree）的大小来分析网络中的节点，节点的自由度值越大颜色越深，其在网络中的地位越重要.

图3 “活性成分-核心靶点”网络图

2.4 核心靶点GO功能分析和KEGG通路富集

将核心靶点上传至DAVID数据库进行GO功能分析和KEGG通路富集，得到GO功能分析条目428条，其中，生物学过程（Biological Process，BP）389条，主要涉及T细胞增殖的正调控、血小板脱颗粒、表皮生长、肽基酪氨酸磷酸化、细胞对药物的反应等；细胞成分（Cell Component，CC）16条，涉及细胞核、细胞质、细胞外间隙、蛋白质复合物、受体复合物等；分子功能（Molecular Function，MF）23条，与蛋白磷酸酶、染色质、血红素、细胞因子活性、血小板衍生生长因子受体结合等相关.均取排名靠前的10个条目作图（图4）.

图4 核心靶点GO功能分析

由图5可知，五神汤参与的通路主要有T细胞受体信号通路、HIF-1信号通路、PI3K/Akt信号通路、TNF信号通路、Toll样信号通路等，其中，P值最小、目标基因最多的是PI3K/Akt信号通路，富集因子最高的是HIF-1信号通路.

图5 核心靶点KEGG通路富集

2.5 关键成分-核心靶点分子对接结果

通过Cytoscape 3.7.2计算PPI网络的拓扑参数，将关键成分槲皮素与核心靶点进行分子对接.由PDB数据库得到蛋白ID编号为3sz1（VEGFA）、1x7j（ESR1）、5ii2（PTGS2）、1x7r（NOS3）、4eh3（TNF），利用Pymol软件对排名前三的结果进行输出优化（图6）.通常情况下，结合能越低，关键成分与靶点之间亲和力越高，表2结果表明，关键成分槲皮素与核心靶点具有较强的亲和力.

图6 槲皮素-核心蛋白对接模式

表2 槲皮素与核心靶点对接情况

3 讨论与结论

3.1 五神汤治疗丹毒核心靶点分析

本研究采用网络药理学方法和分子对接技术对五神汤治疗丹毒的机制进行研究，筛选获得五神汤治疗丹毒的核心靶点有VEGFA、ESR1、PTGS2、NOS3、TNF等.其中，VEGFA具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移及血管形成等作用，也是组织生长和修复所必需的［10］.VEGFA的表达下调可明显减轻炎症并促进血管生成［11］.TNF不仅是典型的促炎因子，还能诱导VEGFA的合成，研究证实其在丹毒病情进展中发挥核心作用［11］.丹毒病灶局部缺氧溃烂等除了炎性反应外，还与血管功能异常相关.PTGS2是丹毒生成的关键基因之一［12］，当受到细胞因子、炎性介质、缺氧等刺激可迅速上调，主要产物前列腺素具有促进血管生成等生物学活性.人血管内皮型NOS3诱导释放的内皮型NO对促进血管舒张、参与血管生成调控发挥重要作用，NOS3基因表达异常，导致生成NO的量不稳定，造成血管内皮功能紊乱，病理状态下NO合成减少导致内皮素-1等缩血管物质相对占优势、血管处于收缩及缺氧状态，局部皮肤细胞迅速坏死，影响人体的免疫系统［13］.因此，VEGFA、ESR1、PTGS2、NOS3、TNF等靶点在炎性反应及血管内皮损伤中具有调节作用，决定了它们成为五神汤治疗丹毒的核心靶点.

3.2 五神汤治疗丹毒关键成分分析

研究表明，局部及全身炎性反应是丹毒最主要的病理基础，大量炎性因子合成分泌并形成炎性级联反应.通过网络药理学分析得到五神汤治疗丹毒的关键成分为槲皮素，槲皮素可以通过下调TNF-a、NF-kB等因子的表达而起到抗炎作用，从而阻止局部组织损伤、溃烂［14-15］；通过分子对接进一步验证了槲皮素与核心靶点有较高的亲和力（结合能均≤-8 kcal/mol），结合位点均有稳定的氢键和疏水键，构象稳定，其中对接最稳定的是槲皮素与VEGFA的结合（-10.1 kcal/mol）.结果表明，五神汤关键成分与受体蛋白稳定结合，可以起到治疗丹毒的作用.

3.3 GO功能分析及KEGG通路富集结果

GO功能分析结果显示，五神汤治疗丹毒的21个核心靶点生物学过程主要涉及T细胞增殖的正调控、血小板脱颗粒、表皮生长等过程.KEGG通路富集结果表明，核心靶点通路主要富集在PI3K/Akt信号通路、HIF-1号通路及TNF信号通路.朱磊等［16］发现，当皮肤组织受到缺血-再灌注损伤时，活化的PI3K/Akt能够抑制细胞凋亡，促进细胞存活，介导皮肤损伤修复，且槲皮素可抑制PI3K/Akt信号通路介导丹毒患者成纤维细胞增殖，并导致细胞周期停滞和凋亡.HIF-1信号通路是生物处于低氧状态下的应激信号通路，张哲等［17］发现，缺氧刺激可增加丹毒患者血管内皮生长因子、血管生成素1的合成分泌，进而引起血管异常增生，血管渗透性增加，血管周围组织发生水肿，导致丹毒形成.SI等［18］发现，槲皮素干预可明显降低丹毒患者成纤维细胞中HIF-1α的表达，促进丹毒患者成纤维细胞凋亡.TNF信号通路能够调节细胞凋亡、炎症反应与免疫应答，槲皮素可以下调TNF-α表达，从而通过TNF信号通路影响免疫平衡，减轻组织或者细胞炎症反应［19］.

3.4 结论

五神汤可作用于PTGS2、ESR1、NOS3、AKT1、TNF、VEGFA等核心靶点，调控PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路和TNF信号通路等多条信号通路，从抗炎、调节免疫系统、舒张内皮血管等多个方面共同治疗丹毒，具有多成分、多靶点、多通路的作用特点.