樱桃根颈腐烂病病菌分离鉴定

李淑平 张 伟 王新语 李 晶 张焕春*

（1山东省烟台市农业科学研究院，烟台 265500；2烟台大学生命科学学院，烟台 264005）

甜樱桃是我国北方种植经济效益最高的树种之一，我国从20世纪80年代开始引种栽培，目前全国栽培面积超过13.5万hm2。樱桃根颈腐烂病是樱桃生产中的一种致死病害，在樱桃的新老产区均有发生，严重影响樱桃的产量和品质。本研究在樱桃的主产区烟台，以患根颈腐烂病樱桃树为试材，对其病原菌进行分离、鉴定，以期为该病害的田间防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在山东烟台的蓬莱、福山区、牟平区等樱桃主产地，共8个采样点，选择樱桃根颈腐烂病树，切取病健交界的皮层和木质部组织，放入干净的采集袋内，带回实验室分离培养。

1.2 病菌分离

在超净台上，先切取较大病斑组织 （1 cm左右小块），置于70%乙醇中浸3～5 min，再将病斑组织移入0.1%HgCl2溶液中浸3～5 s，消毒后切取病斑组织中央部分，经灭菌水漂洗3次后，转移到PDA培养基上，放入生化培养箱，25℃培养。

1.3 r-DNA-ITS序列分析

利用改良CTAB法提取致病病菌DNA，采用ITS4 （5′-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3′）和TTS5 （5′-GGAAGTAAAAGTCGTAAGAAG-3′）作为通用引物。按常规应体系50 μL：10×PCR buffer 5 μL，Taq 酶 1 μL，dNTP 1 μL，上游引物1 μL， 下游引物 1 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 40 μL。 扩增条件：94 ℃预变形性 5 min；94 ℃变性 30 s，54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共35个循环；最终72℃延伸10 min。

回收PCR产物，将目的片段连接到载体Pmd19-T Vector上，进行转化，挑选PCR检测为阳性的菌落，接种到Amp+LB液体培养基中，180 r/min 37℃摇菌过夜，按质粒提取试剂盒小量提取质粒。用pMD19-T载体引物M13（-47）和 M13（-48）双向测序，测序结果拼接，于 http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/上 BLAST 比对。

1.4 致病性测定

供试植物为2年生美早樱桃苗，试验部位为根颈处，接种时间为6月份。先用灭菌棉棒蘸取灭菌水把试验部位擦净、晾干，再用75%酒精消毒、晾干。用缝衣针针刺需接种部位，1 cm2约刺10个孔。以5 mm打孔器在培养 3 d的供试菌株菌落边缘打取菌饼作为接种体。接种菌饼后，用灭菌棉球蘸无菌水覆盖接种部位，外缠保鲜膜保湿。对照处理不接种菌饼，其它步骤相同。用红色油漆笔标记接种部位。每个处理5株。保湿48 h后，拆除保鲜膜，接种部位用湿润的土覆盖，并经常检查确保湿润。2个月后观察发病情况。确定发病的植株，再采集病样进行分离、鉴定。与接种病菌分子鉴定结果相同的，确定为致病菌。

2 结果与分析

2.1 病菌分离鉴定

将烟台的8个樱桃根颈腐烂病发病地点采集到的病样经分离纯化，得到10个菌株，经致病性测定及分子鉴定，结果见表1。

表1 8个樱桃采样点病菌分离鉴定情况

有8个菌株可引起发病：1株撕裂蜡孔菌，1株赤球丛赤壳，1株粗毛栓菌属白腐菌，3株拟茎点霉属病菌，2株尖孢镰刀菌。另鉴定到木霉 菌 属 （Trichoderma album） 和 粪 壳 菌 纲（Sordariomycetes）各 1株，不能引起发病。

2.2 病菌培养特征

5种病菌在PDA培养条件下，均未产生孢子。25℃暗培养4 d，各菌落形态如图1。赤球丛赤壳菌落白色，菌丝绒毛状细密，均匀，菌落直径为3.8 cm。拟茎点霉属菌落白色，致密，菌落正面高低不平，菌落直径为7.8 cm。撕裂蜡孔菌菌落白色，菌丝稀疏，菌落直径为7.4 cm。粗毛栓菌属白腐菌，菌落白色，呈射轴状，疏密相间，菌落直径为6.5 cm。尖孢镰刀菌菌落正面白色，反面粉红色，菌丝绒毛状，细密均匀，菌落直径为3.9 cm。

图1 引起樱桃根颈腐烂病的病菌

2.3 致病性测定

在夏季高温多雨季节，樱桃接种病菌，1个月后可发现根颈部位有白色菌丝缠绕。刮开树皮，可见病菌由针刺部位侵染，围绕针刺点纵深发展。前期预备试验显示，如没有刺伤，接种病菌后1年仍未表现出病症，说明病菌主要从伤口侵入。

接种2个月后调查，对照只在针刺点形成褐色疤痕，周围腐烂状，但并不深入。接种病菌的树体，外表被白色菌丝缠绕，刮开树皮后，已分辨不出接种的针刺孔，病组织相连，和田间樱桃根颈腐烂病树症状相似。

图2 5种真菌在樱桃苗上的接种效果

3 讨论与结论

樱桃根颈腐烂病在樱桃产区时有发生，轻者影响果实品质，严重的造成整株树死亡。根据多点采样分析及分子鉴定，确定有5种真菌可造成樱桃根颈腐烂，即尖孢镰刀菌、拟茎点霉属菌、粗毛栓菌属白腐菌、赤球丛赤壳和撕裂蜡孔菌。

拟茎点霉属和尖孢镰刀菌这两类病菌，在国内多有报道。拟茎点霉属是重要的植物病原，可引起溃疡、烂茎、果腐、叶枯、枝枯、根腐、树皮坏死等多种症状[1-2]。尖孢镰刀菌是一种世界性分布的病原真菌，寄主范围广泛，可引起100多种植物维管束萎蔫病害[3-4]。由本实验分离鉴定结果可知，引起樱桃根颈腐烂病的病菌中，8个发病点，有3个点分离到拟茎点霉属菌，占37.5%；2个点分离到尖孢镰刀菌，占25%。

吕劲峰等[5]在广东鸡蛋果上报道发现了赤球丛赤壳，称该病原菌主要侵害根、茎交界处，横切病茎可见木质部变褐，可引起大量植株迅速凋萎死亡。

关于粗毛栓菌属白腐菌的文章，大多为此菌在造纸中用来生物降解纤维的应用研究，Milenkovic M等[6]报道，此菌在埃塞俄比亚可引起泡桐衰退病。Jelena等[7]利用此菌来降解木质素。目前国内没有此菌引起病害的报道。

关于撕裂蜡孔菌，李淑平[8]前期发表的文章有所介绍。通过后续4种病菌的发现，说明引起樱桃根颈腐烂的病原不同，但发病症状相似。推测或许还有其它病菌可引起此病。而且，试验中发现，只有针刺接种，才可以导致发病，说明这几种病菌是通过伤口侵染，因此在樱桃的生产管理中，为防止根茎腐烂病的发生，要保护好根颈部位，尽量避免造成伤口。这也解释了为什么冬天冻害严重年份，翌年此病大爆发，是因为冻害造成了伤口，利于病菌的侵染。