不对称二甲基精氨酸与新生儿持续性肺动脉高压病理进程的相关性研究

张雯婷 陆琴 丁洁珺 顾猛

（1.南通大学附属常州儿童医院儿科实验室，江苏常州 213003；2.常州市气管炎研究所药学研究室，江苏常州 213003；3.南通大学附属常州儿童医院新生儿科，江苏常州 213003）

新生儿持续性肺动脉高压（persistent pulmonary hypertension of the newborn，PPHN）是指出生后由于胎儿循环向成人型循环过渡失败从而产生的以肺血管阻力持续增高、肺动脉压高于体循环动脉压、严重低氧血症和中心性发绀为临床特征的病理状态［1］。每1 000例活产儿中有2例发生PPHN，其病死率高达4%～33%［2］。PPHN的病因和病理进程尚不完全明确，亟待探索［3］。

内源性一氧化氮（nitric oxide，NO）是血管内皮释放的具有舒张血管活性的物质，它在胎儿出生后循环过渡的过程中发挥着重要作用：NO由内皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）响应肺部血流压力和血氧的变化而产生，从而发挥一系列生物学作用，包括舒张肺部血管、缓解肺部炎症和促进肺泡发育等［4］。不对称二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）是一种内源性的eNOS抑制剂和血管内皮风险因子，它竞争性地与L-精氨酸（eNOS的结合位点）结合从而减少NO的释放，引起血管舒张障碍和一系列心、肺血管并发症［5-6］。ADMA还通过增加氧化应激压力、调节趋化因子信号通路和炎症因子-炎症相关受体交互作用等方式引起血管内皮功能和血管舒张障碍［7-8］。尽管ADMA的下游生物学效应包括血管抵抗和舒张血管障碍等都与PPHN病理进程密切相关，但其在PPHN中的角色极少被探索。

在本研究中，我们拟探讨ADMA作为潜在PPHN疾病标志物和药物治疗靶标的可能性。为此，我们采用柱前衍生化-高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）检测了30例PPHN和20例非PPHN足月新生儿出生后2周之内血清中的L-精氨酸、ADMA及其不被酶解代谢的同分异构体对称二甲基精氨酸（symmetric dimethylarginine，SDMA）的浓度，以此探究ADMA在PPHN足月新生儿循环系统中的变化情况，为进一步明确ADMA在PPHN进程中的角色和后续开展对应的PPHN药学防治研究提供详实数据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

前瞻性选取2018年2月至2019年12月在常州市儿童医院新生儿科确诊PPHN的患儿30例为研究对象，纳入标准：（1）符合PPHN诊断标准；（2）胎龄≥37周且＜42周；（3）入组时出生日龄＜3 d。PPHN患儿中20例合并有不同程度的肺炎，9例合并胎粪吸入综合征，1例合并缺氧缺血性脑病和重度窒息。另选取胎龄和日龄与PPHN患儿匹配的在新生儿科接受治疗或观察的非PPHN新生儿20例为对照组，其中16例为新生儿肺炎，2例为面部挫伤伴轻度肺炎，2例为唇腭裂。PPHN的诊断符合中华医学会儿科学分会制定的《新生儿肺动脉高压诊治专家共识》的诊断标准［9］。排除标准：排除包括房间隔缺损、室间隔缺损等先天性异常，多器官功能衰竭，肝酶升高及碱性磷酸酶异常等对甲基化精氨酸水平有影响的疾病。本研究经常州市儿童医院伦理委员会审查批准（2017-014），并在样本采集前获得患儿家长知情同意。

1.2 血清样本采集

采集两组患儿入组第1、7、14天的全血样本后，立即以3 500 r/min离心10 min，留取上清液于-80℃冰箱储存待测。

1.3 血清中L-精氨酸及其甲基化代谢物的HPLCMS/MS检测

样品前处理：室温解冻后的血清样本以1∶3（v/v）的比例用超纯水稀释，加入内标高精氨酸溶液（500μmol/L），加入乙腈作为蛋白沉淀剂后以15 000 r/min离心10 min。取上清液于80℃水浴中空气吹干，以4∶1（v/v）的比例加入盐酸正丁醇（1 mol/L）作为柱前衍生化试剂，65℃水浴温孵15 min。挥干盐酸正丁醇，加入100μL超纯水复溶样品，11 500 r/min离心10 min后取上清再次离心，最后取上清5μL进样。

色谱条件：5.0μm ODS C18色谱柱（岛津，日本），柱温：40℃；流动相A/B：甲醇/醋酸铵水溶液（10 mmol/L，pH4.0）。采用梯度洗脱，条件设定为：0～3 min，18%A；3～3.1 min，18%A转换到60%A；3.1～5.5 min，60%A；5.5～5.6 min，60%A转换到18%A。

质谱条件：离子源：电喷雾离子源正离子模式（ESI+）；电离电压：4.5 kV；毛细管温度：380℃；雾化气和气帘气：氮气30 L/min；辅助气：氮气10 L/min；扫描方式：正离子扫描；监测模式：SRM。母离子/子离子对的选择：L-精氨酸，231/70，20 eV；ADMA，259/214，20 eV；SDMA，259/228，20 eV；内标，245/84，15 eV。

1.4 统计学分析

用GraphPad Prism 6.0进行数据分析，正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用两样本t检验；两组不同时间点测定数据的变化值使用混合效应模型进行比较。非正态分布计量资料以中位数（四分位数间距）［M（P25，P75）］表示，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料用百分率（%）表示，两组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PPHN组与对照组一般资料

两组在胎龄、性别、出生体重、出生方式、胎粪吸入发生率和入组年龄方面比较差异无统计学意义（P＞0.05），但PPHN组的5 min Apgar评分显著低于对照组（P＜0.05），窒息发生率显著高于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 两组一般资料比较

30例PPHN组患儿中有13例接受吸入NO治疗，给药方案为初始剂量20 ppm，氧合稳定后逐渐降至5～6 ppm维持；23例使用米力农，给药方案为先给予负荷剂量50～75μg/kg，静脉滴注30～60 min后给予维持剂量0.50～0.75μg/(kg·min)；8例使用西地那非，给药方案为鼻饲管每次注入西地那非0.5～1.0 mg/kg，每6 h给药1次。其中，联合使用吸入NO和米力农治疗共7例，联合使用米力农和西地那非治疗共5例，联合使用吸入NO、米力农和西地那非治疗1例。

2.2 两组不同时间血清精氨酸甲基化代谢物水平变化

在对照组和PPHN组新生儿血清中，ADMA的浓度在入组两周内持续上升（P＜0.05），但上升过程有所区别：在入组第7天，PPHN组血清ADMA水平显著高于对照组（P＜0.05）；但在第1天和第14天两组ADMA水平差异无统计学意义（P＞0.05）。提示PPHN病理状态可能与ADMA在循环系统中的浓度上升过程提前有关。

与ADMA的变化趋势相反，在对照组和PPHN组新生儿血清中，其同分异构体SDMA的浓度出现持续下降，从而造成ADMA/SDMA比值上升（P＜0.05）。PPHN组和对照组的SDMA水平、ADMA/SDMA比值在各时间点差异均无统计学意义（P＞0.05）。

血清L-精氨酸在两组中出现温和上升的趋势，入组第14天时，PPHN组和对照组的L-精氨酸水平均显著高于同组第1天的水平（P＜0.05）。PPHN组与对照组的L-精氨酸水平在各时间点差异均无统计学意义（P＞0.05）。

在PPHN组中，NO利用率的替代指标L-精氨酸/ADMA比值在入组第7天和第14天均显著低于入组第1天（P＜0.05），而对照组的L-精氨酸/ADMA并未随时间出现显著波动（P＞0.05）。见表2。

表2 入组第1、7、14天血清精氨酸甲基化代谢物水平比较 （±s）

表2 入组第1、7、14天血清精氨酸甲基化代谢物水平比较 （±s）

注：［ADMA］不对称二甲基精氨酸；［SDMA］对称二甲基精氨酸。a示与同组第1天比较，P＜0.05；b示与同组第7天比较，P＜0.05。对照组：第1天n=20；第7天n=14；第14天n=8。PPHN组：第1天n=30；第7天n=28；第14天n=26。

第14天0.70±0.20 0.82±0.24a 11.483 0.509 ADMA(μmol/L)组别对照组PPHN组F值P值SDMA(μmol/L)第1天0.73±0.19 0.69±0.27 47.674 0.867第7天0.79±0.10 0.99±0.26a 35.695 0.004第14天1.04±0.15a,b 1.17±0.39a 26.766 0.470第1天1.05±0.19 1.02±0.23 46.077 0.914第7天0.86±0.26a 0.82±0.22a 20.288 0.970 L-精氨酸(μmol/L)第1天44±14 39±11 32.860 0.465第7天48±8 42±12 34.407 0.194第14天57±12a 51±13a,b 10.005 0.601组别对照组PPHN组F值P值ADMA/SDMA L-精氨酸/ADMA第1天0.71±0.21 0.69±0.22 42.636 0.986第14天1.56±0.31a 1.44±0.29a,b 9.045 0.790第7天0.99±0.33a 1.22±0.27a 20.345 0.144第14天56±13 46±12a 9.225 0.291第1天62±25 62±23 39.184 0.999第7天61±8 43±10a 28.832＜0.001

2.3 不同预后PPHN患儿血清精氨酸甲基化代谢物及其他实验室指标的水平变化

入组7 d后，经治疗，30例入组的PPHN患儿中有18例肺动脉收缩压（systolic pulmonary arterial pressure，sPAP）低于35 mm Hg；检测分析28例患儿血样（2例患儿血样因出现溶血未被采用），发现与经7 d治疗后sPAP≤35 mm Hg的PPHN患儿相比，经7 d治疗后sPAP＞35 mm Hg的PPHN患儿存在显著的动脉氧分压和动脉氧分压/吸入氧浓度比值降低，血清中ADMA和L-精氨酸的含量出现显著的上升（P＜0.05），见表3。

表3 入组7 d后不同预后PPHN患儿实验室检测指标比较 （±s）

表3 入组7 d后不同预后PPHN患儿实验室检测指标比较 （±s）

注：［PaO2］动脉氧分压；［PFR］动脉氧分压/吸入氧浓度；［sPAP］肺动脉收缩压；［ADMA］不对称二甲基精氨酸；［SDMA］对称二甲基精氨酸。*示全部18例sPAP≤35 mm Hg的PPHN患儿中，2例患儿血样出现溶血未被采用，所得数据对应的实际例数为16例。

n 组别sPAP≤35 mm Hg sPAP＞35 mm Hg t值P值PFR(mm Hg)356±105 156±59 5.969＜0.001 sPAP(mm Hg)25±3 43±9 7.910＜0.001 ADMA(μmol/L)0.89±0.25*1.14±0.20 2.896 0.007 SDMA(μmol/L)0.77±0.19*0.91±0.24 1.780 0.086 18 12 PaO2(mm Hg)109±22 71±16 5.139＜0.001 L-精氨酸(μmol/L)37±12*49±9 3.000 0.006 L-精氨酸/ADMA 42±10*44±10 0.577 0.569 ADMA/SDMA 1.17±0.20*1.31±0.33 1.451 0.158

3 讨论

PPHN是一种致死性和致残率均较高的疾病，其原发或继发于非肺部疾病，导致新生儿出现严重的低氧血症和中心性发绀。大量的研究表明NO缺乏和内皮功能障碍对PPHN病理进程有着关键影响［10-11］。NO吸入是美国食品药品监督管理局批准的用于治疗PPHN、舒张肺血管的重要治疗方案，但是在新生儿中经常出现治疗效果不理想［12］。多中心随机对照试验证实吸入性NO治疗虽然可以有效改善50%PPHN患儿的氧合情况，并显著减少体外膜肺氧合的使用率，但对致死率和致残率没有显著改善［13］；甚至有研究表明，继发于膈疝的PPHN在实施吸入性NO治疗后会造成更差的后果［13］。因此，寻找新的药学线索和治疗方案是目前PPHN治疗中的热点研究领域。

ADMA是蛋白质结合的精氨酸在精氨酸甲基转移 酶（protein-arginine methyltransferases，PRMT）的作用下被二甲基化继而水解得到的氨基酸。ADMA通过竞争性抑制NOS的活性减少NO的产生和NO非依赖的两类方式发挥多效的生物学效应，造成肺血管抵抗，增加肺血管压力。在本研究中，我们发现PPHN病理进程可能与ADMA的自然上升过程提前有关，表现为PPHN组新生儿血清ADMA在入组第7天显著高于对照组，而在第1天和第14天没有显著差异。此外，本研究中还发现较高的ADMA水平与PPHN的治疗响应不佳有关，表现为治疗7 d后，sPAP仍然高于35 mm Hg的PPHN患儿血清ADMA浓度显著高于肺动脉压力控制理想的患儿。因此，本研究提示ADMA参与足月儿肺动脉高压的病理进程，且有可能是潜在的药物治疗靶标。

体内多于80%的ADMA由二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶（dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH）进行代谢，因此DDAH的表达和活性是ADMA水平的决定因素之一［14］。SDMA是ADMA的同分异构体，亦由PRMT催化前体L-精氨酸而产生，但其不被DDAH代谢，而是以原型从尿液排出。因此，ADMA/SDMA比值常被用作DDAH活性的替代指标［15］。本研究发现足月儿出生后两周内ADMA水平逐步上升，SDMA则持续下降，同时ADMA/SDMA比值持续上升，这一现象同时发生在PPHN组和对照组中，表明在足月儿出生后两周内DDAH的表达和活性可能存在以下降为总体趋势和特征的发育过程。有研究表明，新生猪体内DDAH2的表达和活性在出生后保持上调，在1日龄达到顶峰，此后保持持续下降，直至成年，这一发现与我们的临床结果吻合［16］。

在低压缺氧条件诱导出的PPHN猪模型的肺组织中，DDAH2的表达和总DDAH活性显著低于正常猪，表明DDAH的表达或活性异常与PPHN形成有关［16］。在本研究中，入组第7天，PPHN组血清ADMA和ADMA/SDMA的不同程度增高提示PPHN病理条件下ADMA在循环系统中的累积与DDAH活性降低有关，结合高ADMA水平与治疗响应不佳的发生有关，多角度表明ADMA/DDAH通路是PPHN病理进程的重要参与者。

此外，线粒体氧化应激压力增加和由此造成的氧化应激敏感的信号通路的变化对包括PPHN在内的多种心肺疾病的发生起着直接的致病作用［17-18］。ADMA在造成eNOS解偶联的过程中，不仅引起NO的释放减少，还会产生大量的超氧自由基，从而造成氧化-还原平衡的失调。一方面，氧化应激在肺血管重塑和肺血管内皮功能障碍的过程中扮演核心作用，从而增加肺动脉高压的发生和严重程度［19］；另一方面，DDAH对氧化还原状态极为敏感，其发挥催化活性的关键位点Cys-249位上的-SH基团易被氧化失活，从而造成ADMA的降解减少并进一步造成氧化应激加重，形成恶性循环，放大ADMA对内皮和心血管的毒性效应［20］。因此，有研究认为ADMA是包括肺动脉高压在内的多种心血管疾病的独立风险因子，而调节ADMA水平可能产生独立于调节NO之外的其他益处［21］。临床前研究表明，具备ADMA拮抗能力的他汀类药物在实验动物中表现出了抗肺动脉高压的保护作用［22］。此外，产前给予辛伐他汀能够预防硝基芬诱导的先天性膈疝动物模型中出现肺血管重塑和PPHN［23］。结合本研究结果，我们认为ADMA造成心肺损害的机制与其促氧化应激的机制有关，抑制ADMA生物学功能是极具潜力的PPHN治疗新思路。

综上所述，足月儿PPHN病理进程可能与其循环系统中ADMA上升过程提前有关；血清ADMA水平的升高与PPHN治疗抵抗有关。因此，调节ADMA及其代谢酶DDAH的活性可能是未来提高PPHN治疗响应，甚至预防PPHN发病的潜在药学干预策略研发思路。