典型四环素类抗生素的预测无效应浓度和风险评估

陈丽红，李强，肖欣欣，孟甜，张瑜，魏占亮，曹莹

中国环境科学研究院环境检测与实验中心，北京 100012

四环素类抗生素是一类广谱抗生素，主要包括天然类(四环素、土霉素和金霉素等)及半合成衍生物(强力霉素、甲烯土霉素和二甲胺四环素等)，其中使用最多的是土霉素、四环素和金霉素[1]，主要应用于临床治疗和水产养殖业中。据统计，我国每年约生产2.1×105t抗生素，其中，四环素类抗生素是生产和使用比例均较大的一类[2]。由于抗生素不能完全被机体吸收，未被吸收利用的抗生素会通过各种方式进入水体以及土壤环境中。进入环境中的抗生素会诱导大量耐药性致病菌的出现，从而给生态环境安全带来严重威胁[3-5]。

已有研究表明，中国农业土壤中土霉素、四环素和金霉素的平均质量分数范围分别为0～8 400﹑0～2 450和0～5 520 μg·kg-1[6]。与国外调查相比，中国农业土壤中四环素类抗生素污染较严重。例如，西班牙、荷兰和意大利农业土壤中土霉素的平均质量浓度分别为15.7～105.4﹑0.67和127～216 μg·kg-1，西班牙农业土壤中四环素平均质量浓度范围为18.8～64.3 μg·kg-1，丹麦农业土壤中金霉素的质量浓度范围为0.6～15.5 μg·kg-1[7-9]。

化学物质风险评价技术指导文件(Technical Guidance Document on Risk Assessment, TGD)针对现有和新化学物质，提出预测无效应浓度(predicted no effect concentration, PNEC)作为风险评价的生态安全阈值[10]，其推导方法与水质基准的定值方法基本一致[11]。推导方法主要有评价因子法(evaluation factor, AF)、物种敏感度排序法(species sensitivity rank, SSR)、物种敏感度分布法(species sensitivity distribution, SSD)和平衡分配法。在我国，杨灿[12]通过SSD法推导出四环素水质慢性PNEC值为0.758 μg·L-1；杜雪[13]和秦延文等[14]采用评价因子法，推导出土霉素的水质急性PNEC值分别为4.5 μg·L-1和1.04 μg·L-1。然而，针对四环素类抗生素在淡水沉积物和土壤中的PNEC值和对应风险尚未报道。

本研究以四环素和土霉素为例，基于我国本土生物物种的毒性数据。利用SSR法推导水质PNEC值，同时与SSD法的计算结果进行了比对。采用平衡分配法推导沉积物和土壤的PNEC值，并应用提出的PNEC值对我国部分地区水质、淡水沉积物和土壤的暴露生态风险进行了初步评估，研究结论可为四环素类抗生素水质、淡水沉积物和土壤标准制定提供建议，为我国四环素类抗生素污染监测和生态系统保护提供参考。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 四环素和土霉素生态毒性数据筛选

生态毒性数据来自国内外已发表的文献和报告。筛选原则为：(1)为我国本土物种；(2)所有毒性数据都要求有明确的测试终点、测试时间及对测试阶段或指标的详细描述；(3)对于同一物种在同一毒性终点有多个毒性值时，求几何平均值[15]。

1.2 水质PNECwater的推导方法

1.2.1 物种敏感度排序法(SSR)

采用SSR法计算四环素和土霉素的最终慢性值(FCV)[16]。计算步骤为：(1)搜集与筛选数据；(2)求每个物种的物种平均慢性值(SMCV)和每个属的属平均慢性值(GMCV)；(3)从高到低对GMCV排序；(4)对GMCV设定R个级别(1～N)；(5)计算SMCV的累积概率(P)，P=R/(N+1)；(6)选择累积概率最小的4个属平均慢性值，用这4个属平均慢性值和它们的累积概率计算最终慢性值(FCV)。计算公式如下：

(1)

(2)

(3)

FCV=eA

(4)

式中：S、L和A为计算中采用的中间符号，没有特殊含义；GMCV为属平均慢性值；P为累积概率；FCV为最终慢性值。

在慢性数据缺乏的情况下，可以采用急慢性比值法计算FCV。首先，通过与求得FCV类似的方法先获得最终急性值(FAV)，FCV为FAV与最终急慢性比(FACR)的比值。

PNECwater为FCV和最终植物值(FPV)两者中的最小值，FPV是用藻类所做的96 h实验或者是用水生维管束植物所做的慢性实验得出的结果中的最小值。

1.2.2 物种敏感度分布法(SSD)

采用荷兰公共健康与环境研究所(RIVM)推荐的EXT 2.0风险评估软件拟合SSD曲线[17]，并计算HC5(5%物种危害浓度，单位为μg·L-1)，PNECwater计算公式如下：

PNECwater=HC5/AF

式中：AF为评价因子，取值范围为1～5，该研究中AF取值5[18-19]。

1.3 淡水沉积物PNECsusp的推导方法

由于缺乏淡水沉积物的生物毒性数据，因此PNECsusp采用平衡分配法进行推导[20]，计算公式如下：

(5)

RHOsusp=Fsolidsusp·RHOsolid+Fwatersusp·RHOwater

(6)

(7)

Kpsusp=FOCsusp·Koc

(8)

式中：PNECsusp为沉积物环境预测无效应浓度(mg·kg-1)；PNECwater为水环境预测无效应浓度(mg·L-1)；RHOsusp为悬浮物体积密度(kg·m-3)，Ksusp-water为悬浮物-水分配系数(m3·m-3)，Kpsusp为污染物在悬浮物中的固-水分配系数(L·kg-1)；其他参数及取值列于表1中，Koc为有机碳-水分配系数(L·kg-1)，其值从EPI Suite V4.10软件获得，优先使用软件数据库中的实测值，没有实测值则采用软件计算值。

1.4 土壤PNECsoil的推导方法

1.4.1 平衡分配法

由于土壤生物利用率及毒性效应与土壤性质有关，不同类型土壤试验数据不能相比较，因此应将试验结果转化为标准土壤数据。无观察效应浓度(NOEC)与半数致死/有效浓度(L(E)C50)的校正公式如下[20]：

(9)

式中：Fom土壤(标准)为标准土壤中有机质的比率(kg·kg-1)，默认值为3.4%；Fom土壤(试验)为试验土壤中的有机质比率(kg·kg-1)。

如果无法获得土壤生物毒性数据，采用平衡分配法计算PNECsoil[20]，公式如下：

(10)

PNECsoil的计算公式类似于PNECsusp，Ksoil-water为土壤-水分配系数(m3·m-3)，其余参数的释义及取值列于表1。

1.4.2 评估因子法

如果获得土壤毒性数据，采用评估因子法计算PNECsoil，如表2所示。

如果仅获得一项土壤生物毒性数据，需同时采用平衡分配法和评估因子法计算，选择PNECsoil较低值。

1.5 生态风险评估

采用风险商值(risk quotient, RQ)法[20]对我国部分地区淡水沉积物和土壤中四环素和土霉素的暴露风险进行评估，将四环素和土霉素的暴露浓度除以获得的PNEC值，得到RQ。若RQ>1，则有风险；若RQ<1，则无风险。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 四环素和土霉素水质PNECwater

2.1.1 SSR法推导四环素水质PNECwater

四环素的水生生物急性毒性数据筛选结果如表3所示，共获得5门8科10个急性毒性数据[12,21-23]。同时获得3门3科3个慢性毒性数据(表4)[12,24]。由于慢性毒性数据没有达到3门8科的最低要求，故采用计算FCV的方法先推导FAV值。选择最敏感的4属：浮萍棘尾虫(Stylonyciia属)、大型溞(Daphnia属)、天蓝喇叭虫(Stentor属)和绿藻(Pseudokirchneriella属)，依据式(1)～(4)求得四环素的FAV为0.532 μg·L-1。再采用FAV除以FACR求得FCV值。其中，FACR为斑马鱼、大型溞和扁藻的急慢性比率(ACR)的几何平均值(表4)。PNECwater为FCV和FPV两者中的最小值，在比较四环素对浮游植物及大型水生植物的毒性数据后，FPV采用文献报道的绿藻(Chlorophyta)3 d-NOEC(0.002 mg·L-1)，最终得到四环素的PNECwater值为0.115 μg·L-1。

表1 化学物质风险评价技术指导文件(TGD)中默认的环境参数[20]Table 1 The default environmental parameters in Technical Guidance Document on Risk Assessment (TGD)[20]

2.1.2 SSD法推导四环素水质PNECwater

由于四环素慢性毒性数据不足，将表3中急性毒性数据除以FACR得到慢性毒性数据。利用RIVM推荐的EXT 2.0风险评估软件分析慢性毒性数据，拟合曲线如图1所示，得到PNECwater为4.32 μg·L-1。

表2 推导土壤环境预测无效应浓度(PNECsoil)的评估因子[20]Table 2 Assessment factors for devivation of predicted non-effect concentration of soil (PNECsoil)[20]

表3 四环素的水生生物急性毒性值Table 3 Acute toxicity data of tetracycline for freshwater species

图1 四环素的慢性物种敏感度分布曲线注：SMCV表示种平均慢性值。Fig. 1 The chronic species sensitivity distribution curves of tetracyclineNote: SMCV stands for species mean chronic value.

2.1.3 SSR法推导土霉素水质PNECwater

土霉素的水生生物慢性毒性数据筛选结果如表5所示。共获得4门10科12个慢性毒性数据[25-35]，已达到3门8科的最低要求。选择最敏感的4属：金头鲷(Sparus属)、斑点叉尾鮰(Ictalurus属)、近头状伪蹄形藻(Pseudokirchneriella属)和水蕴草(Egeria属)，计算出土霉素的PNECwater为4.93 μg·L-1。

2.1.4 SSD法推导土霉素水质慢性PNECwater

土霉素SSD曲线拟合结果如图2所示，求得HC5为114 μg·L-1，PNECwater为22.8 μg·L-1。

本研究采用SSR法推导四环素和土霉素的PNECwater，同时与SSD法的计算结果进行了比对，选择PNECwater较低者用于风险表征。因此，四环素和土霉素的PNECwater值为0.115 μg·L-1和4.93 μg·L-1(表6)。

2.2 四环素和土霉素淡水沉积物PNECsusp

由于缺乏四环素和土霉素的淡水沉积物毒性数据，本研究采用平衡分配法计算PNECsusp。除Koc以外的参数均采用TGD的默认值。按照式(5)～(8)求得四环素和土霉素的PNECsusp分别为423 μg·kg-1和1.78×104μg·kg-1(湿质量)。

表4 四环素的最终急慢性比率(FACR)Table 4 Final acute to chronic ratio (FACR) of tetracycline

表5 土霉素的水生生物慢性毒性值Table 5 Chronic toxicity data of oxytetracycline for freshwater species

表6 四环素和土霉素的预测无效应浓度(PNEC)值Table 6 Predicted no effect concentration (PNEC) value of tetracycline and oxytetracycline

图2 土霉素的慢性物种敏感度分布曲线Fig. 2 The chronic species sensitivity distribution curves of oxytetracycline

2.3 四环素和土霉素土壤PNECsoil

采用植物慢性毒性试验中黑麦草10 d-NOEC值5 mg·kg-1[36]推导四环素PNECsoil值，应用评价因子100，求得PNECsoil为0.05 mg·kg-1(湿质量)。该文献采用国际经济合作与发展组织(OECD)试验标准，默认有机质含量3%(Fom土壤(试验))，通过式(9)，将NOEC值(5 mg·kg-1)转化为标准土壤数据NOEC(标准)为5.67 mg·kg-1，得到PNECsoil为0.057 mg·kg-1(湿质量)。

土霉素PNECsoil值采用赤子爱蚯蚓14 d-NOEC值2.56×103mg·kg-1[35]进行推导，应用评价因子100，得到PNECsoil为25.6 mg·kg-1(湿质量)。但由于该文献试验中未报道试验土壤的有机质含量和含水率，因此本研究未对该毒性数据进行标准化处理，因此可能造成PNECsoil值偏低。

由于本研究仅获得一项土壤生物毒性数据，故同时采用评估因子法以及平衡分配法，选择PNECsoil较低者用于风险表征。采用平衡分配法求得四环素和土霉素的PNECsoil分别为68.5 μg·kg-1(湿质量)和3.16×103μg·kg-1(湿质量)。因此，四环素PNECsoil采用评价系数法推导的57 μg·kg-1(湿质量)，土霉素采用平衡分配法推导的3.16×103μg·kg-1(湿质量)。

2.4 我国部分地区水质中四环素类抗生素的生态风险评估

将我国部分地区江河和湖泊中四环素类抗生素的暴露浓度与本研究推导的土霉素PNECwater值(4.93 μg·L-1)相比较[37](表7)。水质中常检出的四环素类抗生素为土霉素和四环素，由于此类抗生素具有较高的分配系数，容易吸附在悬浮物或沉积物中，在水质中检出的频率和暴露浓度较低。结果显示，所有区域的此类抗生素暴露浓度均未超过土霉素的PNECwater值。

表7 我国部分地区水质中四环素类抗生素浓度Table 7 The concentrations of tetracycline antibiotics in freshwater of China

2.5 我国部分地区淡水沉积物中四环素和土霉素的生态风险评估

将本研究推导的四环素和土霉素PNECsusp与我国部分地区淡水沉积物中暴露浓度进行比较[38-41](表8)，结果显示，我国大部分地区淡水沉积物中四环素和土霉素浓度均低于PNECsusp值，四环素浓度范围最低的是辽河(ND～4.82 μg·kg-1)，最高的是海河(2.0～135 μg·kg-1)，表明我国大部分地区淡水沉积物中四环素处于可接受水平，但部分点位四环素浓度高于PNEC值，如海河的少数断面高达135 μg·kg-1，是PNECsusp的1.47倍，高四环素浓度可能会对底栖水生生物造成危害，值得关注。土霉素浓度范围最低的是长江三角洲(0.3～14.0 μg·kg-1)，最高的是辽河(2.34～652 μg·kg-1)，均低于PNECsusp，说明我国大部分地区淡水沉积物中土霉素处于可接受水平。

2.6 我国部分地区土壤中四环素和土霉素的生态风险评估

根据收集的四环素和土霉素土壤暴露浓度[42-59]，结合推导的PNECsoil值，计算我国部分地区土壤中四环素和土霉素的RQ值，结果分别如表9和表10所示。由表9可知，25个区域中有5个区域的土壤RQ>1。RQ值从大到小依次为山东省(3.998)>四川省彭州市(3.823)>辽宁省沈阳市(3.512)>浙江省北部(1.561)>珠江三角洲(1.237)。9个区域(四川省彭州市、浙江省宁波市、珠江三角洲、江苏省徐州市、山东省、天津市、福建省莆田市、浙江省北部、辽宁省沈阳市)的土壤四环素最高值超过本研究提出的PNECsoil57 μg·kg-1，这些土壤存在潜在生态风险，值得关注。

表8 我国部分地区淡水沉积物中四环素和土霉素的含量Table 8 The concentrations of tetracycline and oxytetracycline in freshwater sediments of China

表9 我国部分地区土壤中四环素的含量Table 9 The concentrations of tetracycline in soil of China

表10 中国部分土壤中土霉素的含量Table 10 The concentrations of oxytetracycline in soil of China

由表10可知，我国部分地区土壤中土霉素的含量范围介于0～8.40×103μg·kg-1[42-43,45-49,51-56,59-62]，将本研究推导出的土霉素PNECsoil与我国部分地区土壤暴露浓度相比较，结果显示，23个区域中有1个区域的农田土壤(上海市)的平均暴露浓度超过PNECsoil，RQ为1.229。江苏省徐州市、浙江省北部和上海市的最高值超过本研究提出的PNECsoil3.16×103μg·kg-1，这些土壤具有潜在的生态风险，应当引起重视。

2.7 不确定性分析

生物毒性数据的筛选、不同的PNEC值推导方法、沉积物和土壤中四环素和土霉素的暴露浓度变化是生态风险评估过程中产生不确定性的主要因素。首先，水生生物的区系分布具有很强的地域性，这不仅体现在国内外物种差异中，在我国不同流域中分布的水生生物也存在较大差异，因此受试生物的筛选是水质PNEC推导的重点之一，本研究筛选的水生生物均为我国的本土水生生物。其次，有文献报道氨氮、镉等水质PNEC受温度、pH和溶解性有机碳(DOC)等水质参数的影响[63]，因此，在筛选毒性数据时，需要进一步分析这些参数对毒性数据的影响。但目前尚未有文献报道水质参数对四环素和土霉素PNEC的影响。此外，不同的推导方法也会影响PNEC值。最后，由于四环素和土霉素在沉积物和土壤中的暴露浓度数据有限，为了更全面精确地了解四环素和土霉素的暴露情况，需要进一步搜集整理并开展全国范围沉积物和土壤中四环素和土霉素暴露浓度的数据监测。

综上所述，本研究结果表明：

(1)运用TGD推荐的计算PNEC方法，推导出我国水质、淡水沉积物及土壤中四环素的PNEC值分别为0.115 μg·L-1、423 μg·kg-1(湿质量)和57 μg·kg-1(湿质量)；土霉素的PNEC值分别为4.93 μg·L-1、1.78×104μg·kg-1(湿质量)和3.16×103μg·kg-1(湿质量)。

(2)应用获得的四环素、土霉素PNEC值对我国部分地区水质、淡水沉积物和土壤进行暴露生态风险评价，结果表明水质无暴露风险，处于可接受水平，沉积物风险区域主要集中在海河，土壤风险区域主要集中在山东省、四川省彭州市、辽宁省沈阳市、浙江省北部、珠江三角洲、浙江省宁波市、江苏省徐州市、天津市、福建省莆田市和上海市，部分区域点位存在潜在的生态风险。