网状纤维染色中银氨离子的解离规律

蔡育波，曲春华，黄辉，李海成，李荣岗，周伟，陈杰伟，3*

（1广东省江门市中心医院病理科，江门 529000；2中山大学附属肿瘤医院病理科，广州 510060；3广东省食管癌研究所，广州 510060）

网状纤维源自于网状细胞，主要由III型胶原蛋白交错排列成网状故称网状纤维，属于疏松结缔组织中的一种成分，因其原纤维上包裹一层特殊的嗜银糖蛋白，而被称为嗜银纤维[1-2]。网状纤维以网状支架和上皮基膜的形式广泛存在于组织中，网状纤维的增减，断裂，崩解，都预示着疾病的发生和进展，因此网状纤维染色在病理诊断中得到广泛应用[1]。由于改良Gordon-Sweets法中对网状纤维结合的银氨离子Ag(NH3)2+在水中解离规律未见文献报道，实践中网状纤维染色效果稳定性及一致性较差，影响病理诊断；为了改善染色质量，提高病理诊断准确性，本研究通过实验对其解离规律进行揭示及验证。

材料与方法

1 材料

收集10例来自江门市中心医院病理科的肝脏手术切除组织石蜡标本及中山大学肿瘤防治中心的146例肝癌病例组织石蜡标本。

2 改良Gordon-Sweets法染色

由两位授权的中级病理技术员严格按照改良Gordon-Sweets法操作规程进行染色，银氨液新鲜配制，银氨液经验证效果符合诊断要求。将10例肝脏大体切除石蜡标本按照4um连续切片，在65℃烤箱中30min，二甲苯梯度酒精脱蜡至水，接着按照改良Gordon-Sweets法操作规程进行染色：①酸化高锰酸钾液氧化5min后稍水洗。②2%草酸漂白2min后稍水洗，再用蒸馏水水洗。③2%硫酸铁氨液媒染5min后蒸馏水稍水洗。④Gordon-Sweets银氨液作用1min。⑤将连续切片分别用两缸蒸馏水进行浸洗，两缸蒸馏水浸洗时间相同，浸洗总时间分别为30s、60s、90s、110s、120s、130s、150s、3min、5min、10min、15min、20min。⑥10%中性甲醛液还原1min后流水冲洗10min。⑦核固红液染胞核10min后稍水洗。⑧脱水透明，中性树胶封固。以上实验均在常温下进行。

3 评价及验证

由两位主治病理医师独立评分，网状纤维着色强度按强中弱进行评价（强为3分，中等强度为2分，弱为1分）；背景采用信噪比评价，分为优、良、差3个等级；根据病理诊断要求对染色效果从0—10分进行评分，最差为0分，最好为10分；选择最佳染色方法（最佳的染色强度对应的方法）对146例肝癌病例组织进行染色，验证该方法的有效性。

4 统计学分析

采用SPSS V16.0 进行数据分析，计量资料用均数±标准差表示，统计资料率比较采用χ2检验，以P＜0.05差异为具有统计学意义。

结 果

切片在蒸馏水浸洗30s至2min之间，网状纤维染色强度不变，均染成棕黑色，不同时间点均有9例呈强阳，1例呈中等强度，但1min前的切片残留银离子较多，信噪比差；随着时间增加信噪比逐步改善，在蒸馏水浸洗2min时网状纤维染色强，定位准确，且背景干净，信噪比最佳；2min后网状纤维结合Ag(NH3)2+开始逐步解离，镜下网状纤维由棕黑色渐变紫色，15min以后Ag(NH3)2+多完全解离，网状纤维变成紫红色，不能满足病理诊断（图1、2，表1）。根据两位主治病理医师盲评结果进行统计分析显示：切片在蒸馏水中浸洗2min，评分均值最高，为9.9±0.31，能够满足病理诊断需求（表2）。

图1 银氨溶液反应后不同蒸馏水浸泡时间对网状纤维染色效果的影响。比例尺，20μmFig. 1 The effect of different distilled water immersion time after silver ammonia solution reaction on the reticular fiber staining. Scale bar, 20μm

表1 Gordon-Sweets网状纤维染色后蒸馏水浸洗时间对染色效果的影响Tab. 1 Effect of distilled water immersion time after Gordon-Sweets reticular fiber staining on the staining result

图2 银氨溶液反应后银氨离子在蒸馏水中解离曲线Fig. 2 Dissociation curve of silver ammonium ions in distilled water after reaction in silver ammonia solution

表2 Gordon-sweets网状纤维染色后蒸馏水浸洗时间对病理诊断评分的影响Tab. 2 Influence of distilled water immersion time on the pathological diagnosis score

在146例的肝癌病例组织切片中采用Gordon-sweets网状纤维染色后蒸馏水浸洗120s的最佳方法进行网状纤维染色，稳定性及一致性好，优片率达到98.6%(144/146)，不但满足临床病理诊断，也改善了诊断医生阅片的体验。

讨 论

网状纤维有多种染色方法，最常应用的是改良Gordon-Sweets法，该方法主要利用酸化高锰酸钾把网状纤维表面嗜银糖蛋白的羟基氧化成醛基，然后在媒染剂的作用下与Ag(NH3)2+结合，经甲醛还原后变成黑色的金属银，把网状纤维染成黑色[1]。有研究显示：银氨液配制有效与否是网状纤维染色的成功的关键，因此银氨液需新鲜配制，并及时使用，才能保证网状纤维染色质量[3]。同时由于自来水中含有氯离子可以与Ag(NH3)2+反应生成氯化银沉淀，影响染色质量，因此在银氨液反应后应用蒸馏水进行冲洗[4,5]。现有理论上并没有明确蒸馏水水洗时间，导致病理技术从业者在行网状纤维染色时，个体化差异明显，染色质量不稳定，批间差明显，影响病理的鉴别诊断。

本研究严格按照改良Gordon-Sweets法的要求进行配制银氨液，并验证其有效性，及时运用于本实验中，试剂的有效性保证了本实验的质量。研究显示氢氧化二氨合银是一种络合物，能够溶解于水，可完全电离[6]。根据氢氧化二氨合银能在水中可完全电离的特性，本实验在银氨液反应完后设置了不同的水洗时间并多次重复实验，发现了网状纤维结合的

Ag(NH3)2+在蒸馏水中的解离规律，切片经银氨液反应完后在蒸馏水中浸洗2min时不但能获得最佳的染色效果，强度合适，信噪比佳，可以满足临床病理诊断，也提高了病理诊断医生的阅片的体验；而在蒸馏水中浸洗2min后，网状纤维结合的Ag(NH3)2+开始逐步解离，网状纤维由棕黑色渐变成紫红色，直到15min至20min时银氨离子完全解离，网状纤维变成深紫红色，不能满足病理诊断。本研究初步揭示了网状纤维结合的Ag(NH3)2+在蒸馏水中的解离规律，为网状纤维染色实践操作提供了规范化的参考。

本实验经反复验证发现了改良Gordon-Sweets法中对网状纤维结合的Ag(NH3)2+在水中解离规律，有效地指导了网状纤维的染色，解决了实践中由于银氨液反应后水洗时间的不确定导致网状纤维染色效果稳定性较差，个体化差异明显的问题，提高网状纤维染色的稳定性及一致性，值得在临床实践中进一步推广应用。