银香解毒膏通过抑制炎症反应减轻皮肤金黄色葡萄球菌感染和促进毛囊生长

周安，钱忠亚，石洪，李爱兰，王桂兰，孙素娴，丁国兵

（泰州市姜堰中医院普外科，泰州，225500）

金黄色葡萄球菌是一种驻留在皮肤和鼻粘膜中的微生物，具有致病的潜在致病性，可引起多种社区和医院获得的感染。随着金黄色葡萄球菌感染病例趋多，其治疗也越来越困难。由金黄色葡萄球菌引起的皮肤感染包括原发性脓皮病，而涉及软组织的感染包括蜂窝织炎和脓性肌炎，感染的严重程度决定治疗方法的选择[1-3]。涉及皮肤和软组织的感染很常见，感染范围从表浅到深部，从大面积到局部的，感染可为自限性的，亦可能迅速蔓延甚至威胁生命[4]。目前，β-内酰胺类抗生素是对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌感染的主要治疗药物[5,6]，但是，对于耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌感染，无论是社区获得性感染还是医院获得性感染，都是一个日益严重的问题。

外用药物治疗是中医外科学的一大特色，传统上有很多外用制剂，其作用效果良好，然而与现代医学中一些外用制剂相比，其作用机制不明，限制了大多数外用制剂的推广应用。参考中医中药书籍，我科自制银香解毒膏，具体方剂如下：金银花、乳香、蜈蚣、白芷、藿香、苦参、野菊花、黄柏、地肤子。本研究通过建立体表感染小鼠模型，即建立疮疡模型，观察银香解毒膏是否可以降低皮肤层中性粒细胞的招募，抑制皮肤NF-κB以及凋亡信号通路，修复皮肤毛囊或者促使毛囊生长，为银香解毒膏的未来临床应用提供科学依据。

材料和方法

1 小鼠

实验动物及分组：8周龄、体重20～25g、SPF级的C57小鼠60只，雌雄各半，随机分成银香解毒膏组、莫匹罗星组、赋形剂组3组，每组各20只（雌雄各半），于SPF环境中以标准条件饲养（标准饲料自由进食，自由饮水，日夜光照各12h，控制室温22～24℃，湿度50%-60%）。南京中医药大学实验动物中心定期对小鼠进行致病原检测以确保小鼠符合实验要求。

2 主要试剂

免疫荧光一抗：兔抗LY-6G（美国Gibco公司，SC-20088）；荧光二抗：FITC标记的山羊抗兔IgG（美国Gibco，SA00003-2）；Western blot一抗：兔抗BAX (ab182734)、兔抗BCL2 (ab182858)、兔抗p65(ab32536)、兔抗磷酸化p65(p-p65) (ab239882)和兔抗GAPDH (ab9485)；Western blot二抗：羊抗兔IgG H&L（ab6721）；KeyFluor594-Click-iT EdU成像检测试剂盒（南京凯基，KGA331-50）；山羊封闭血清、OCT冰冻包埋剂、苏木精、伊红、HistoChoice透明剂、牛血清蛋白（BSA）均购自Gibco公司。多聚甲醛、抗荧光猝灭剂、DPBS、无水酒精、Triton X-100 原液等其常规试剂均为国产分析纯。

3 银香解毒膏的制备

将金银花3钱、乳香2钱、蜈蚣3钱、白芷4钱、藿香3钱、苦参6钱、野菊花3钱、黄柏2钱、地肤子3钱称量好，混合一起将药物碎为粗末，用水加热煮出，约2～3次，至药物中可溶性物质全部溶出为度；置火上蒸发浓缩，加定量的蜂蜜，浓缩至稠膏状。

4 标本制备

使用“胶带剥脱法”建立小鼠金黄色葡萄球菌感染模型：小鼠麻醉后，背部皮肤备皮剃毛，生理盐水擦拭皮肤，无菌棉球擦拭干净生理盐水，再以弹性胶带于背部皮肤上连续粘扯，撕脱动物的皮肤表皮，然后在撕脱表皮部位滴注金黄色葡萄球菌液，作用约4h后完成细菌吸收。当背部部位出现明显红肿、皮薄光亮、触及软化，有脓液为造模成功。小鼠感染24h后，使用银香解毒膏，莫匹罗星膏、赋形剂膏进行涂抹感染部位，实验中统一用量。另外，各组小鼠造模部位皮下注射40μl用0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.2～7.4）稀释的细胞增殖标记物EdU（20μmol/L）。按照实验设计时间，分别在涂抹药物治疗后的第3d和第5d时皮肤取样，进行OCT冰冻包埋，液氮速冻1h，-80°C冰箱冷冻48h，使用莱卡冰冻切片机制作8μm厚度的切片，正电荷防脱载玻片吸附冰冻切片，-20°C冰箱中冷冻保存备用。

5 常规病理染色与免疫荧光染色

冰冻切片自然晾干30 min后，用苏木精-伊红（H.E，碧云天，C0105S）染色法染色，奥林巴斯可视化显微镜下观察并拍照。

冰冻切片自然晾干30min后，用0.1mol/L PBS配制的4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗3次，1% Triton-X 100透膜20min，滴加含3%牛血清蛋白（BSA）和含10% 正常山羊血清的PBS各250μl，湿盒内4℃下孵育1h；轻轻倒去孵育液，然后滴加一抗LY-6G（1:150），以PBS代替一抗做阴性对照，4℃湿盒孵育过夜；PBS清洗3次，滴加荧光二抗（1:200）及DAPI，4℃湿盒避光孵育1h；PBS冲洗3次，抗荧光猝灭剂封片, 蔡司倒置可视化荧光显微镜暗房内观察和拍照。采用Image J软件对获取的绿色LY-6G荧光图像进行二值化，使用Particles功能对LY-6G阳性炎性细胞进行计数。

6 蛋白质印迹分析

在RIPA缓冲液（1%Triton X-100、15 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA和10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物按照，蛋白提取流程，对细胞或者线粒体蛋白进行提取和制备，然后通过10%SDS-PAGE进行蛋白分离，然后电泳转移到PVDF膜上，随后将PVDF膜放入5%脱脂牛奶中封闭2h后，随后在室温下与以下第一抗体孵育：抗BAX（1:500）、BCL2（1:500）、p65（1:1000）、p-p65（1:1000）和GAPDH（1:2000）抗体 (均购置abcam)，4℃孵育过夜后，PBST清洗3次，每次10 min，继而进行二抗羊抗兔IgG H&L（1:2000）孵育2h，最后PBST清洗3次，每次10 min； ECL（PE0010-100，Solarbio）孵育后应用化学发光凝胶成像系统（培清JS-M6, 上海培清科技有限公司）检测。采用ImageJ软件对获取的蛋白条带图像进行光密度测定，以目的蛋白与内参蛋白GAPDH光密度值比值作为相应目的蛋白的相对水平。

7 EdU染色

在干细胞增殖标记物EdU标记的的皮肤组织冰冻切片上滴加1ml 4%多聚甲醛室温固定30min后3% BSA漂洗2次，每次5min，继而用0.5% Triton X-100透膜20min，再使用3% BSA漂洗2次，每次5min，去除透膜剂；滴加KeyFluor594 Click-iT反应混合物（根据说明书现用现配），室温避光孵育30min，以PBS代替KeyFluor594 Click-iT 反应混合物做阴性对照；弃去Click-iT反应混合物，3%BSA漂洗2次，每次5min，去除反应混合物，然后滴加1:1000稀释的5μg/ml 的DAPI，湿盒避光孵育3min，3% BSA漂洗2次，每次5min，去除反应混合物，最后滴加抗荧光猝灭剂，盖玻片封片，蔡司倒置可视化荧光显微镜暗房观察拍照。采用ImageJ软件对获取的红色EdU荧光图像进行二值化，使用Particles功能对EdU阳性细胞进行计数。

8 统计分析

数据表示为来自3个独立实验的平均值±SEM。本实验研究所获得所有数据（中性粒细胞数目、EDU阳性细胞、BAX，BCL2等蛋白表达的相对水平）均采用Student’s t检验进行两两比较统计分析，P ＜0.05被认为统计学显著差异。

结 果

1 银香解毒膏抑制金黄色葡萄球菌感染皮肤中性粒细胞招募

小鼠皮肤感染金黄色葡萄球菌后，赋形剂治疗组第3d皮肤的横切面中，免疫荧光染色观察到大量LY-6G标记的中性粒细胞[7]（绿色，LY-6G表达在中性粒细胞膜上）招募到感染部位的皮肤中，分散在皮肤毛囊组织之间；在第5d时，招募的中性粒细胞开始围绕毛囊组织聚集成团（图1）。

莫匹星罗治疗组中，在第3d皮肤的横切面上，可清楚地见到中性粒细胞招募，但较赋形剂治疗组明显减少，也未见中性粒细胞聚集围绕在毛囊周围；治疗后第5d，中性粒细胞招募数目较第3d显著增加，但低于赋形剂治疗第5d（图1）。

银香解毒膏治疗组中，治疗第3d和第5d时，皮肤组织损伤不明显，皮肤损伤部位均无明显中性粒细胞招募，也未见中性粒围绕毛囊聚集成团现象（图1）。

图1 银香解毒膏对金黄色葡萄球菌感染皮肤中性粒细胞招募影响的免疫荧光检测。A，小鼠皮肤HE染色与LY-6G免疫荧光染色的代表性图像，蓝色为DAPI染色的细胞核，绿色为LY-6G免疫荧光标记的中性粒细胞；标尺，100μm。B，中性粒细胞招募量的定量统计分析；*，与同组内第3d比较，0.01＜P＜0.05；**，与同组内第3d比较，P＜0.01；#，与赋形剂同时间点比较，0.01＜P＜0.05；##，与赋形剂同时间点比较，P＜0.01；@，与莫匹罗星同时间点比较，0.01＜P＜0.05；@@，与莫匹罗星同时间点比较，P＜0.01Fig. 1 Immunofluorescence detection for the effect of Yinxiang Jiedu ointment on the recruitment of neutrophils in the skin lesions infected by Staphylococcus aureus. A, representative images of mouse skin lesions stained with HE and LY-6G immunofluorescence, with blue showing DAPI stained cell nuclei and green showing the neutrophils labeled with LY-6G; scale bar, 100μm. B, statistical analysis of recruitment of neutrophils; *, 0.01＜P＜0.05,compared with 3rd day in the same group; **, P＜0.01, compared with 3rd day in the same group; #, 0.01＜P＜0.05, compared with excipient at the same time point; ##, P＜0.01, compared with excipient at the same time point; @, 0.01＜P＜0.05, compared with mupirocin at the same time point; @@ P＜0.01,compared with mupirocin at the same time point

2 银香解毒膏抑制金黄色葡萄球菌感染皮肤凋亡与炎症信号通路的激活

Western blot检测显示：在金黄色葡萄球菌感染的皮肤中，赋形剂治疗第5d与第3d比较，BAX、BCL2和p-p65的水平均无明显变化；与赋形剂组比较，莫匹罗星治疗组中BAX水平呈下降趋势，BCL2水平呈上升趋势；与赋形剂组和莫匹罗星组比较，银香解毒膏治疗组中BAX和p-p65水平显著下降，BCL2水平显著升高，银香解毒膏治疗组中BAX和p-p65水平的下降幅度和BCL2水平升高幅度较莫匹罗星更大。莫匹罗星治疗和银香解毒膏治疗第5d的BAX、BCL2和p-p65水平与第3d 比较均无明显差异，各组和不同治疗时间之间的p65水平均无明显变化（图2）。

图2 银香解毒膏对金黄色葡萄球菌感染皮肤凋亡与炎症信号通路活性的影响。A， BAX、BCL2，p65、p-p65水平的代表性Western blot检测。B—D，BAX、BCL2和 p-p65水平统计学分析；*，与赋形剂同时间点比较，0.01＜P＜0.05；**，与赋形剂同时间点比较，P＜0.01；#，与莫匹罗星同时间点比较，0.01＜P＜0.05；##，与莫匹罗星同时间点比较，P＜0.01Fig. 2 The effect of Yinxiang Jiedu ointment on the apoptosis and inflammation signaling pathway in Staphylococcus aureus infected skin lesions.A, representative Western blot detection of the level of BAX, BCL2, p65 and p-p65. B to D, statistical analysis of the level of BAX, BCL2 and p-p65, respectively; *, 0.01＜P＜0.05, compared with excipient at the same time point; ** P＜0.01, compared with excipient at the same time point; #,0.01＜P＜0.05, compared with mupirocin at the same time point; ##, P＜0.01, compared with mupirocin at the same time point

3 银香解毒膏促进毛囊细胞再生

EdU染色检测显示：赋形剂治疗组的毛囊细胞增殖非常缓慢，在赋形剂治疗第5d，毛囊增殖的细胞数量与治疗第3d比较几乎没有变化；与赋形剂治疗相比，莫匹罗星治疗第3d和第5d的毛囊细胞的增殖数目均明显上升，但莫匹罗星治疗第5d与第3d比较无显著差异；而在银香解毒膏治疗组，毛囊细胞增殖数目不仅多于赋形剂治疗组，也显著多于莫匹罗星治疗组，而且银香解毒膏治疗第5d的毛囊细胞增殖数目显著高于第3d（图3）。

图3 银香解毒膏对金黄色葡萄球菌感染皮肤毛囊细胞增殖的影响。A，小鼠皮肤EdU染色代表性图像，蓝色为DAPI染色的细胞核，红色为增殖的毛囊细胞；标尺，20μm。B，EdU染色毛囊细胞数量的统计学分析； **，与同组内第3d比较，P＜0.01； ##，与赋形剂同时间点比较，P＜0.01； @@，与莫匹罗星同时间点比较，P＜0.01Fig. 3 The effect of Yinxiang Jiedu ointment on the proliferation of hair follicle cells in the skin lesions infected by Staphylococcus aureus. A, representative EdU staining images of mouse skin lesions, with blue showing the DAPI stained cell nuclei, and red showing the EdU-stained proliferating hair follicle cells; scale bar, 20μm. B, statistical analysis of the number of the EdU-stained hair follicle cells; **, P＜0.01, compared with 3rd day in the same group; ##, P＜0.01, compared with excipient at the same time point; @@, P＜0.01, compared with mupirocin at the same time point

讨 论

金黄色葡萄球菌是一种驻留在皮肤和鼻粘膜中的细菌，具有潜在致病性，可引起多种社区或医院获得性感染。金黄色葡萄球菌形成生物膜的能力以及多药耐药菌株的出现是决定应对这些感染的难度[8]。β-内酰胺类抗生素是对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌感染的主要治疗药物。但是抗生素的选择也取决于当地金黄色葡萄球菌的敏感模式。大环内酯类，克林霉素和科曲唑是社区获得性MRSA（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus）的药物选择，而万古霉素则用于治疗由多重耐药性MRSA菌株引起的感染以及疑似心内膜炎或严重脓毒症的患者[9]。尽管目前临床用药中，已经出现多种新的抗生素，例如利奈唑胺和喹诺丁素/达福普汀对MRSA具有良好的活性，但这些药物只能在专家建议下使用。此外，抗生素的滥用导致部分致病菌产生变异、成为耐药菌株，使得感染性疾病的治疗变得棘手，加重医疗负担[9]。

外用药物治疗是中医外科学的一大特色，传统上有很多外用制剂，其作用效果良好，然而其作用机制不明，限制了大多数外用制剂的推广应用，甚至使得部分制剂逐渐消失。阐明传统制剂的作用机理具有重要意义。例如，近年来如意金黄散被广泛运用于中医外科临床各疾病中，如湿疹、皮肤疮疡肿痛、脉管炎等常见疾病。并且有大量的实验研究显示，如意金黄散有明显的抗炎、镇痛、抗菌效果，对金葡菌等常见病菌有抑制作用[10,11]。有研究指出如意金黄散在炎症反应时可以有效下调TNF-α 及 IL-1、IL-8的表达，控制炎症的发展，并且其清热解毒、消肿止痛的作用可能是通过此机制作用实现的[12,13]。

在本研究中，我们采用自制银香解毒膏用于疮疡外治，具体方剂如下：金银花、乳香、蜈蚣、白芷、藿香、苦参、野菊花、黄柏、地肤子。前期研究发现药膏中的金银花、苦参以及野菊花成分对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌等致病菌有较强的抑制作用，此外，还对钩端螺旋体、流感病毒及致病霉菌等多种病原微生物亦有抑制作用；金银花煎剂能促进炎症反应区白细胞的吞噬杀菌作用。此外，蜈蚣和藿香起到解毒祛湿的功效，乳香和白芷具有活血行气止痛，消肿生肌的功效；地肤子与黄柏具有解毒、清热止痒的功效。在实验中，发现银香解毒膏组对比使用赋形剂或者莫匹星罗药膏的小鼠组，银香解毒膏组小鼠的皮肤红肿程度明显减轻，同时，黄色渗液减少且皮肤损伤程度较轻。免疫荧光染色结果证实，在感染部位皮肤的横切面的中性粒细胞招募的数量较少，表明银香解毒膏的治疗能缓解金黄色葡萄球菌感染导致的皮肤炎症，并具有良好的皮肤渗透能力。此外，银香解毒膏可以抑制炎症信号通路的激活，抑制细胞凋亡信号的活化。毛囊作为皮肤的主要附属器官，在维护皮肤的正常功能中起到至关重要的作用。金黄色葡萄球菌感染部位皮肤毛囊受损，毛囊再生能力下降。银香解毒膏具有很好地扶正解毒，促进毛囊生长的功能。银香解毒膏作用下，药物成分透过金黄色葡萄球菌感染层，或者金黄色葡萄球菌的生物素膜作用于毛囊组织。

总之，此研究初步发现银香解毒膏具有良好的抗炎、抗细胞凋亡功能，对于皮肤的金黄色葡萄球菌感染具有很好的治疗效果，同时还促进毛囊的生长，以维护皮肤正常功能。银香解毒膏的使用可以避免抗生素滥用带来的负面影响。银香解毒膏杀灭金黄色葡萄球菌的具体机制还需进一步探究，后期阐明银香解毒膏药物渗透动力以及对金黄色葡萄球菌生物素膜的抑制机制，对于未来临床药物的推广应用具有一定的指导意义。