液相色谱-质谱联用测定不同软膏中的莫匹罗星

胡玉芬，王丽娟，薛富民

(齐鲁工业大学(山东省科学院)，山东省分析测试中心，山东 济南 250014)

莫匹罗星是荧光假单胞菌的天然发酵产物，化学结构独特(见图1)，而且是近年来临床上使用的惟一的异亮氨酸tRNA合成酶的竞争抑制剂[1]。莫匹罗星通过竞争抑制作用，与细菌接触时可与异亮氨酸转移RNA合成酶结合，从而抑制细菌的蛋白质的合成，最终导致细菌死亡，这是莫匹罗星发生作用的基本原理。另外，莫匹罗星在进入体内后能够被迅速吸收，且很快被体内脏器所水解，其血清半衰期通常低于30 min。莫匹罗星独特的化学结构及抗菌作用机制，决定了其具有良好抗菌作用的同时，与其他各类抗生素无交叉耐药，且长期使用不易产生耐药性[2]。因此，莫匹罗星可作为局部外用抗生素，对与皮肤感染有关的各种革兰氏阳性球菌、某些革兰氏阴性菌有一定的抗菌作用，适用于革兰氏阳性球菌引起的皮肤软组织的感染，如脓疱疮、疖、毛囊炎等原发性感染以及湿疹、皮炎、溃疡、外伤等皮肤病的继发感染[3-10]。显然，在各种制剂中莫匹罗星含量多少与药效有直接的关系，建立针对制剂中莫匹罗星含量的高效、准确分析方法具有重要意义。但是，目前关于莫匹罗星检测方法的报道较少，吕亚光等[11-13]报道了利用液相色谱法检测软膏或喷雾剂中莫匹罗星的含量，马尔蒂·瓦拉等[14]采用液相色谱-质谱联用法只是检测莫匹罗星的代谢产物，而没有报道针对样品中有效成分莫匹罗星的分析方法。另外，耿悦等[15-16]利用液相色谱-质谱联用方法检测莫匹罗星软膏中的杂质及其降解产物，也没有对软膏中有效成分莫匹罗星进行检测方法的研究。在《中国药典》2015年版二部中[17]，也未收录莫匹罗星的检测方法。上述文献报道的液相色谱法检测莫匹罗星灵敏度低、干扰多，对于痕量非法添加则不能准确测定。目前，采用液相色谱-质谱联用法测定软膏中莫匹罗星的含量鲜有报道。因此，亟需建立一种高效、可靠的针对莫匹罗星的检测方法。本实验尝试采用液相色谱-质谱联用法检测莫匹罗星含量，并用于软膏中莫匹罗星的快速检测。

图1 莫匹罗星结构式Fig.1 Structural formula of mupirocin

1 材料

1.1 仪器

Agilent1200型RRLC-6410型三重四级杆串联质谱仪(美国安捷伦科技公司)。

1.2 药品与试剂

样品为某市售莫匹罗星软膏(莫匹罗星质量分数2%)、青鹏软膏、救生堂古方膏。莫匹罗星对照品 (中国食品药品检验研究院，规格：100010， 100 mg，纯度：94.2%)；乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯，所用水均为纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent XDB-C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；流动相： A：0.1%甲酸-水，B：乙腈；流速：0.3 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。梯度洗脱条件：0～7 min，B：30%～90%；7～7.1 min，B：90%～30%；7.1～11 min，B：30%。

ESI离子源正离子模式，多反应离子监测(MRM)模式下选择离子对:501.3→326.7、501.3→308.9和501.3→291。

2.2 对照品贮备液的制备

精密称取莫匹罗星对照品 10.615 7 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理 10 min，溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品贮备液。

2.3供试品溶液的制备

2.4 专属性实验

分别精密量取对照品溶液、供试品溶液各5 μL，进样测定，记录色谱图。提取莫匹罗星特征离子对501.3→326.7、501.3→308.9和501.3→291的总离子流图，莫匹罗星对照品出峰时间在5.45 min左右，阴性供试品在莫匹罗星峰处无干扰峰，阴性供试品加标出峰时间在5.45 min左右，表明本实验条件适用于测定莫匹罗星，色谱图见图2。

图2 专属性实验色谱图Fig.2 Chromatograms of specificity experiments

2.5 标准曲线的制备

分别精密吸取莫匹罗星对照品贮备液适量，用流动相稀释制成含莫匹罗星10、20、50、100、200、500 ng·mL-1的系列溶液，在选定的色谱条件下，进样5 μL，记录色谱图。以峰面积积分值y为纵坐标、莫匹罗星质量浓度x为横坐标进行线性回归，得回归方程y=115.211 3x(r=0.999 5)。结果表明，莫匹罗星检测质量浓度线性范围为10～500 ng·mL-1。

2.6 检测限和定量限

取莫匹罗星对照品储备液逐级稀释，按上述条件进样分析，在满足检测要求的情况下，最终确定4 ng·mL-1为方法的检测限浓度，10 ng·mL-1为方法的定量限浓度。样品添加10 ng·mL-1定量限浓度对照品溶液的质谱检测色谱图如图3所示。

图3 样品添加10 ng·mL-1定量限浓度对照品溶液色谱图Fig.3 Chromatograms of spiked sample with 10 ng·mL-1 control

2.7 重复性实验

100 ng·mL-1对照品溶液，重复进样6次测定，记录峰面积。结果，莫匹罗星峰面积的相对标准偏差为0.8%(n=6)，表明进样精密度良好。

2.8 加标回收实验

精密称取样品1 g，分别精密加入对照品贮备液适量，按2.2项下方法制备并进样测定，计算回收率。结果，低、中、高浓度的加标回收率(n=3)分别为99.8% 、109.2% 和105.0%，相对标准偏差(n=3)分别为3.5%、1.6%和1.4%，详见表1。

表1 回收率实验结果(n=3)

2.9 样品含量测定

分别精密称取3批莫匹罗星软膏、青鹏软膏、救生堂古方膏样品，按2.3项下方法制备供试品溶液，进样测定并计算，结果表明青鹏软膏、救生堂古方膏中未检出莫匹罗星；莫匹罗星软膏中莫匹罗星含量为2%，符合莫匹罗星软膏的标定含量。

3 结论

文中建立了不同软膏中莫匹罗星含量的液相色谱-质谱联用测定方法，该方法线性范围宽，检出限低，专属性好，灵敏度高，简便、快速，可用于不同软膏中莫匹罗星的检测。对于莫匹罗星含量相对较高的软膏可以准确测定，如莫匹罗星软膏，经检测与其标定含量一致；对于市售一些消炎药膏，不含有莫匹罗星，如青鹏软膏，经检测确实未检出莫匹罗星；对于某些保健品中痕量非法添加莫匹罗星，该方法也能进行测定，如救生堂古方膏，经检测未检出莫匹罗星。