周小敏 ,林如英,徐伟伟,郭玮,王玲,周琳瑛,王玮,徐剑文*
(1福建医科大学基础医学院人体解剖学系,福建医科大学临床应用解剖学研究所,脑老化与神经变性疾病福建省高校重点实验室 福州 350122;2 厦门医学院基础医学部人体解剖学与组织胚胎学教研室 厦门361023;3福建医科大学公共技术中心电镜室 福州 350122)
围生期窒息引起的部分或完全缺氧、脑血流减少或暂停而导致胎儿或新生儿脑损伤称为缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)[1,2],是造成新生儿围生期死亡和严重伤残的主要病因[3,4]。神经保护可有效阻断缺氧缺血性神经元死亡的发生,因此从神经保护角度治疗早产儿围生期缺氧已经成为热点领域之一。
Wnt信号通路在神经系统发育中起着多种作用。由Wnt/β-连环素(Wnt/β-catenin)调控的神经源性分化因子1(neurogenic differentiate factor1,NeuroD1)参与胚胎期、出生后神经发生[5],调节神经元分化[6]。NeuroD1与胰岛素(insulin)启动子直接结合,进而激活胰岛素基因表达[7],胰岛素及其特异性受体主要参与大脑敏感区认知处理[8],干细胞自我更新等[9]。研究发现胰岛素和Wnt信号传导通路之间的相互作用能影响胰岛素受体过表达的胰岛β细胞的增殖和功能[10],提示Wnt信号通路和胰岛素/胰岛素受体之间可能存在某种相互作用机制。本研究通过建立短暂缺氧动物模型,观察缺氧后β-catenin、NeuroD1、insulin receptor表达的变化,进而分析缺氧影响Wnt/β-catenin/ NeuroD1通路的可能机制,以及对神经发生的作用。
清洁级Sprague Dawley大鼠,雄鼠12只、体重(220±20)g,雌鼠24只、体重(220±20)g,由福建医科大学实验动物中心提供 [许可证号:SCXK(闽)2016-0002]。大鼠置于鼠笼常规适应性喂养1周,雌雄2:1合笼,母鼠受孕,待其生产后,取3d SD大鼠,雌雄不拘。
尼氏染色液G1430(北京索莱宝生物科技有限公司),Trizol、HiScript® QRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper) 试剂盒、ChamQTM SYBR®qPCR Master Mix试剂盒、SYBR Green荧光定量试剂盒(南京vazyme),牛血清白蛋白(BSA)(碧云天生物技术研究所),兔抗大鼠Active-β-catenin单克隆抗体(美国cell-signaling),山羊抗大鼠NeuroD1多克隆抗体、小鼠抗大鼠insulin receptor单克隆抗体(美国santa-cruz),DAPI(北京索莱宝生物科技有限公司),Dylight488标记的驴抗兔 IgG H&L、Dylight550标记的驴抗小鼠 IgG H&L、Dylight650标记的驴抗山羊 IgG H&L(美国Abcam)。
改良陈惠金[11]、王琍琍[12]等人的方法,往有机玻璃缺氧箱内通入8%O2+92%N2混合气体,将3日龄SD大鼠置于其内缺氧2h后移出,室温环境下恢复15~20min后,返还至母鼠身边继续饲养。对照组将3日龄SD大鼠放入有机玻璃缺氧箱内2h,不通入氮氧混合气体。
造模后24h取对照组、缺氧组大鼠脑组织,制备冰冻切片进行Nissl染色:冰冻切片脱脂至水,将切片置于Nissl染色液,56℃水浴加热浸染1h,双蒸水洗去染色液1min,将切片置于分化液3s,镜下观察分化程度,95%乙醇3s,无水乙醇3s,二甲苯I、二甲苯II各5min,中性树胶封固,光镜下观察海马CA1区、DG区脑组织病理变化。
造模后24h取对照组、缺氧组大鼠乙醚麻醉,取脑并分离出海马CAl区,3%戊二醛—1.5%多聚甲醛—0.1mol/L PB(pH7.2)溶液前固定12h,1%锇酸—1.5%亚铁氰化钾水溶液4℃后固定 1.5h,0.01mol/L PBS漂洗;70%酒精饱和醋酸铀染液块染,酒精—丙酮梯度脱水,纯环氧树脂618 包埋剂包埋。超薄切片100nm,醋酸铀、柠檬酸铅各染色5min,飞利浦EM 208型透射电镜下观察神经元变化。
缺氧组大鼠于建模后2、4、24h断头取脑,同时设立对照组,取海马结构修块后置于4%多聚甲醛溶液4℃固定24h,梯度蔗糖脱水,冷冻切片机以视交叉为界进行连续冠状切片,片厚为5μm。切片用0.01mol/L PBS漂洗5min×3次,10% BSA 室温封闭30min,加入兔抗大鼠active-β-catenin(1:100)、山羊抗大鼠Neuro D1(1:100)、小鼠抗大鼠insulin receptor(1:200)混合液,室温孵育30min后4℃过夜。PBS漂洗5min×3次,滴加二抗混合液(Dylight488标记的驴抗兔 IgG H&L、Dylight550标记的驴抗小鼠 IgG H&L和Dylight650标记的驴抗山羊 IgG H&L Dylight®488标记的驴抗兔 IgG H&L,1:500),避光孵育1.5h。0.01mol/L PBS漂洗5min×3次,滴加DAPI,防荧光猝灭剂封片,Leica SP8 激光共焦显微镜(徕卡公司,德国)下摄片。
分别取造模后2、4和24h 缺氧组和对照组海马结构(n=6),采用Trizol法提取总RNA,再反转录成 cDNA,用DNA荧光染料SYBR Green 对β-catenin、NeuroD1、insulin receptor mRNA表达水平进行检测,各引物序列见表1,内参采用β-actin。选择ABI7500PCR 仪(美国应用生物系统公司,美国)按以下程序进行设置:94℃ 30s预变性,40个循环(94℃ 5s变性,60℃ 34s退火延伸)。然后进行60~95℃熔解曲线分析。通过ABI7500荧光定量PCR仪自带软件ABI7500软件进行数据处理,采用△△Ct法进行基因表达的相对定量分析:目的基因量RQ值=2-△△Ct。
表1 qPCR引物序列Tab 1 The primers for qPCR
所有数据经过方差齐性检验和正态性检验,应用IBM SPSS 20.0进行统计分析。每组数据使用均数±标准差表示,组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验,P<0.05表示各组数据之间有统计学意义。
海马结构冰冻切片尼氏染色显示:对照组新生鼠海马CA1区神经元层次清晰明显,细胞排列规律有序,细胞形态完整正常,核仁明显,胞质中尼氏体丰富,焦油紫染色深且均匀(图1a);DG区细胞分布均匀,背景略呈浅紫色,细胞形态完整,轮廓清晰,尼氏小体呈深紫色,胞核淡染成紫色(图1b)。 缺氧组新生大鼠缺氧后24h CA1区神经元水肿,细胞数量减少,排列层次紊乱,部分细胞胞膜破裂,胞核染色较浅,胞浆内尼氏小体染成淡紫色(图1c),DG区神经元排列不规则,部分胞膜边界不清,细胞间隙增宽变大,细胞形态不完整,核仁模糊,胞内尼氏体染色浅(图1d)。
图1 大鼠海马结构尼氏染色。a,对照组CA1区;b,对照组DG区;c,缺氧组(缺氧后24h)CA1区;d,缺氧组(缺氧后24h)DG区;比例尺,50μmFig. 1 Nissl staining of the hippocampus of rats. a, CA1 region of the control group; b, DG region of the control group; c, CA1 region of the hypoxia group (24h after hypoxia); d, DG region of the hypoxia group (24h after hypoxia); scale bar, 50μm
透射电镜观察显示:短暂缺氧对3d龄大鼠海马CA1区的神经元造成了损伤(图2)。对照组神经元胞核边界明显、染色质分布均匀,胞质中线粒体、内质网、高尔基复合体等细胞器均正常且清晰可辨(图2a、b、c);神经元突起清晰,其内可见平行排列的神经丝等结构(图2c)。缺氧后24h见胞质内细胞器均有不同程度水肿,部分核膜破裂不完整,染色质外溢(图2d),神经元透亮,染色质分布不均,发生肿胀,部分核膜边界不清,部分线粒体肿胀(图2e),神经元突起形态异常,突起内透亮,发生水肿,突起内的神经丝也出现不同程度的水肿(图2f)。
图2 大鼠海马CA1区神经元超微结构。a—c,对照组。d—f,缺氧组(缺氧后24h)。比例尺:a—c,1μm;d和f,0.5μm;e,5μmFig. 2 The ultrastructure of the neurons in the CA1 region of the rat hippocampus. a to c, control group. d—f, hypoxia group (24h after hypoxia). Scale bar: a to c, 1μm; d and f, 0.5μm; e, 5μm
免疫荧光染色显示:active-β-catenin、NeuroD1、insulin receptor分别被绿色、紫色和红色荧光标记,细胞核被DAPI染成蓝色(图3)。与对照组比较,缺氧后2h,3种蛋白的免疫反应强度无明显差别;缺氧后4h,3种蛋白的免疫反应强度较对照组增高;缺氧后24h,3种蛋白免疫荧光染色强度均增高。
图3 大鼠海马结构中active-β-catenin、NeuroD1和insulin receptor免疫荧光染色。比例尺,100μmFig. 3 Immunofluorescence staining of active-β-catenin, NeuroD 1 and insulin receptor in the hippocampus of rats. Scale bar, 100μm
提取两组3d龄SD大鼠在缺氧后2、4、24h的海马结构RNA进行qRT-PCR检测,使用RQ值表示目的蛋白mRNA相对表达量。结果显示:与对照组相比,缺氧后2h,β-catenin、NeuroD1、insulin receptor的mRNA表达量无明显差异;缺氧后4h,β-catenin的mRNA表达量显著降低,NeuroD1和insulin receptor的mRNA表达量显著升高;缺氧后24h,β-catenin和insulin receptor的mRNA表达量无明显变化,而NeuroD 1的mRNA表达量持续升高(图4)。
图4 海马结构β-catenin (a)、NeuroD1 (b)和insulin receptor (c) mRNA相对表达量比较。*P<0.05;**P<0.01Fig. 4 Comparison of the relative mRNA expression level of β-catenin (a), NeuroD 1 (b) and insulin receptor (c) in the hippocampus of rats. *P<0.05;**P<0.01
因高龄产妇数量的增加,导致伴围产期缺氧的早产儿数量同步增长,探讨早产儿缺氧脑损伤有效治疗方法显得尤为重要。已有研究表明,Wnt信号通路在维持细胞增殖、分化和迁移中发挥着重要作用[13],并且调节胰岛素分泌[14]。在成年鼠下丘脑中Wnt3a 通过上调 NeuroD 1 促进胰岛素表达[15]。缺氧后激活Wnt/β-catenin通路有助于保护短暂性全脑缺血[16]。因此,随着基础和临床研究的不断深入,胰岛素/胰岛素受体将可能成为治疗缺氧性中枢神经系统疾病的有效手段之一。
本实验采用3d龄 SD 大鼠模拟早产儿,置于8% O2+92% N2混合气体中持续低氧 2h,通过光镜和透射电镜观察鉴定,成功建立了缺氧性脑损伤模型。进而通过实时荧光PCR检测发现:缺氧后2h,β-catenin、NeuroD 1和insulin receptor的mRNA表达水平无明显变化,与免疫荧光染色检测的3种蛋白的免疫反应性无明显改变的结果一致,可能由于轻度缺氧后机体的应激性反应无法短时间内完全出现[17],此时应激反应主要体现为细胞的氧感受器被激活,使体内各种低氧敏感基因表达上调,从而促使细胞适应低氧环境[18]。
缺氧后4h,与对照组相比,缺氧组β-catenin的mRNA水平明显降低,而NeuroD1和insulin receptor的mRNA水平增高。研究表明:β-catenin最早被发现是作为一种黏附因子,其主要功能是参与细胞之间的相互连接,随后的研究发现β-catenin作为Wnt信号通路中的关键因子参与到缺氧缺血性脑损伤中[19]。我们推测:缺氧导致信号通路上核心分子转录和表达都发生了明显的变化,同类细胞间相互作用减弱,此时β-catenin的mRNA表达量下降。缺氧抑制β-catenin mRNA 表达的同时,可能也抑制β-catenin蛋白磷酸化,导致活化的β-catenin(即非磷酸化β-catenin)升高,进而影响下游NeuroD1基因表达。NeuroD1能促进细胞提前分化为神经前体细胞,参与胚胎和出生后神经发生。缺氧后4h NeuroD1的mRNA表达量增高,推测短暂轻度缺氧可作为特定的外界刺激,激发机体的自我保护机制,高表达的NeuroD1能加快未成熟神经元分化速度,更新受损神经元,减轻缺氧给中枢系统带来的损伤,起到代偿作用。Insulin receptor作为胰岛素功能体现的载体,缺氧后2h由于应激反应的延迟性导致insulin receptor 的mRNA表达量并没有立即发生变化,而是在缺氧后4h开始增高,该结果也与免疫荧光染色结果相符。
缺氧后24h,缺氧组β-catenin和insulin receptor的mRNA表达量较对照组无明显改变,而NeuroD1的mRNA表达量持续增高。实时荧光定量PCR结果显示:缺氧对Wnt/β-catenin/NeuroD1信号通路及insulin receptor的表达产生影响。免疫荧光结果显示:β-catenin、NeuroD1和insulin receptor免疫荧光染色强度均增高。本研究胰岛素受体的改变趋势与贾茜等人的实验结果一致:脑缺血再灌注后分布在梗死区附近胰岛素受体的mRNA和蛋白质表达量均有所增高,mRNA于再灌注后12h达到高峰,蛋白质于再灌注后24h达到高峰[20]。
综上,我们推测缺氧通过上调通路关键因子激活Wnt/β-catenin/ NeuroD1途径,其下游因子变化与神经修复,能量代谢和细胞迁移存在一定相关性,可能缺氧上调海马胰岛素受体,使海马区能量供给重新分配并且促进海马区神经再生,这种代偿性能量供给增加又使得海马区胰岛素受体在短期内维持高水平状态。