4-PBA通过Nrf2/NQO1通路减轻急性汞中毒小鼠肝氧化应激和功能损伤

张雨淼 ，胡珊, ，陈龙, ，张倩，徐春明，王金玲，张红霞, *

（潍坊医学院1附属医院肾内科， 2神经疾病与再生修复实验室，3基础医学院临床病理系，潍坊 261053）

汞是一种常见的毒物，一般以金属汞、无机汞和甲基汞3种化学形式广泛存在于自然环境中，其中氯化汞（HgCl2）是自然过程中最容易形成的一种无机形式。无机汞被机体吸收后会引起多组织器官损伤，如大鼠口服HgCl2会诱导氧化应激造成心脏损伤[1]。Li等[2]研究发现HgCl2通过抑制氧化应激相关蛋白核因子E2相关因子2 （nuclear factor E2 related factor 2, Nrf2）信号通路，对肾脏造成损伤。氧化应激与内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）相关蛋白葡萄糖调节蛋白（GRP78）、C/EBP同源蛋白（CHOP）之间存在一定联系：一方面，Nrf2可通过抑制GRP78、CHOP和半胱氨酸蛋白酶-12（caspase-12）凋亡通路来影响ERS，从而减轻细胞凋亡[3]；另一方面，低水平的GRP78可能通过改变E-钙黏蛋白和波形蛋白的表达，激活Nrf2/HO-1信号通路，增强结肠癌细胞转移和侵袭能力[4]。

4-苯基丁酸（4-Phenylbutyric acid，4-PBA）是ERS特异性阻断剂，可协助蛋白质的折叠，从而减轻ERS[5]。有趣的是，在心脏缺血-再灌注损伤大鼠模型中，4-PBA处理不仅能抑制ERS相关蛋白Grp78、CHOP、pPERK的表达，还能增加SOD、GSH-Px的活性，减少LDH、ROS、MDA的产生，保护心肌免受氧化应激引起的损伤，减少细胞凋亡[6]。因此，本研究通过建立汞暴露小鼠模型，研究4-PBA对小鼠肝脏保护作用以及对氧化应激Nrf2/NQO1通路的影响。以探讨ERS抑制剂4-PBA是否能作用于氧化应激，ERS与氧化应激是否有协同作用。

材料与方法

1 试剂

HgCl2、兔抗Nrf2（美国Sigma-Aldrich公司），鼠抗NQO-1（美国Santa cruz公司），鼠抗GAPDH（美国Cell Signaling Technology公司），DAB显色试剂盒、通用二步法试剂盒（小鼠/兔增强聚合物法检测系统）PV-9000（北京中杉金桥公司），微量丙二醛（MDA）、微量还原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）检测试剂盒（南京建成生物有限公司）。

2 动物与造模

健康清洁级8周龄C57BL/6雄性小鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。18只小鼠随机分为3组：Control组、HgCl2组、HgCl2+4-PBA组，每组6只。小鼠SPF级饲养，自由饮水，光照白天12h，夜间12h，温度25℃，实验开始前适应性喂养3d。对照组（Control）：不给予任何处理。HgCl2组：腹腔注射8mg/kg HgCl2盐溶液处理16h；HgCl2+4-PBA组：腹腔注射20mg/kg 4-PBA，48h后注射8mg/kg HgCl2盐溶液处理16h，建模成功后采集血液和肝脏组织。本动物实验严格遵守《山东省实验动物管理委员会标准》和《潍坊医学院实验动物使用及护理指南》规定。

3 血清生化指标检测

小鼠麻醉后经眼球取血，抗凝血在4℃条件下2500 rpm离心10 min，收集上清液。采用全自动生化分析仪检测谷丙转氨酶（ALT）与谷草转氨酶（AST）水平。

4 肝组织氧化应激指标检测

取肝组织和生理盐水按照重量(g)：体积(ml)=1:9的比例制成10%组织匀浆，4℃条件下4500 rpm离心10 min，收集上清液。按照试剂盒说明书对微量丙二醛（MDA）、微量还原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）及总蛋白含量进行测定。

5 免疫组织化学染色

采用通用二步法，肝组织切片常规脱蜡和水化，经抗原修复、阻断内源性过氧化物酶后用羊血清封闭，然后滴加第一抗体4℃过夜。第二天孵育第二抗体后DAB显色，苏木精复染。最后将切片脱水封片，在显微镜下进行观察。

6 Western blot

提取小鼠肝脏组织蛋白，SDS-PAGE电泳分离，后转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭2h，分别加入相应一抗，4℃孵育过夜；次日二抗室温孵育2h；ECL化学发光法显影。采用Image J图像分析系统对各条带进行分析，以目的蛋白条带与内参照GAPDH条带积分光密度值比值反映目的蛋白的表达水平。

7 统计学分析

采用 SPSS 22.0 统计分析软件，各观察数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），用GraphPad Prime 6作图，以双侧P＜0.05 为差异具有统计学意义。

结 果

1 4-PBA处理抑制汞中毒导致的血清AST和ALT升高

AST和ALT是广泛应用于反应肝损伤的检测指标。与Control组相比，HgCl2处理组AST和ALT水平均显著升高，表明汞中毒引起了明显的小鼠肝损伤；与HgCl2组相比，HgCl2+4-PBA组这两种肝功酶的活性降低（表1）。

表1 汞中毒和4-PBA预处理小鼠血清AST和ALT水平检测Tab. 1 Analysis of the level of AST and ALT in the serum of the mercury poisoned mice with or without 4-PBA pretreatment

2 4-PBA抑制汞中毒诱导的肝组织氧化应激

应用检测氧化应激相关试剂盒分析显示：与Control组相比，HgCl2组肝组织MDA水平升高，GSH水平、SOD和GSH-Px活性降低，抗氧化能力明显降低而脂质过氧化水平升高；4-PBA预处理则使汞中毒引起的肝组织上述氧化应激效应基本被逆转（图1）。

图1 各组肝脏MDA和GSH水平，T-SOD和GSH-Px活性分析。与Control比较：*0.01＜P＜0.05, ** P＜0.01；与HgCl2组比较：#0.01＜P＜0.05，##P＜0.01Fig. 1 The level of MDA and GSH and the activity of T-SOD and GSH-Px in the liver tissues of each group. Compared with the control group:*0.01＜P＜0.05, ** P＜0.01; compared with the HgCl2 group: #0.01＜P＜0.05，##P＜0.01

3 4-PBA抑制汞中毒所致肝组织Nrf2和NQO1降低

免疫组织化学染色表明：Nrf2和NQO1在Control组均匀表达于肝组织细胞质；与Control组比较，HgCl2组肝组织中Nrf2和NQO1免疫反应性显著降低，4-PBA预处理使这种降低明显减少，且在细胞质与细胞核中均有不同程度的Nrf2和NQO1表达，即4-PBA能够促进Nrf2和NQO1核内易位（图2A）。Western blot分析显示，与Control组相比，HgCl2显著降低肝组织中Nrf2和NQO1水平，而使用4-PBA预处理显著逆转HgCl2诱导的肝组织中Nrf2和NQO1水平的降低（图2B）。

图2 汞中毒和4-PBA预处理肝组织中Nrf2/NQO1水平检测。A，Nrf2/NQO1水平与定位的免疫组织化学检测；比例尺，50μm（局部放大图，20μm）。B，Nrf2/NQO1水平的Western blot检测及其统计学分析；与Control比较：**P＜0.01；与HgCl2组比较：#0.01＜P＜0.05，##P＜0.01Fig.2 Evaluation of the level of Nrf2/NQO1 in the liver tissues of mercury poisoned mice with or without 4-PBA pretreatment. A, immunohistochemical examination of the level and localization of Nrf2/NQO1; scale bar, 50μm (the local enlarged view, 20μm). B, Western blot detection and statistical analysis of Nrf2/NQO1 level; compared with the control group: **P＜0.01; compared with the HgCl2 group: #0.01＜P＜0.05; ##P＜0.01

讨 论

研究表明汞对人体和动物的多种器官和组织造成毒性作用，尤其是对肝脏的损害极大，会导致肝衰竭[7]。Ahmad等[8]研究发现主要机制是汞暴露诱导ROS、RNS等自由基大量堆积，引起细胞内氧化还原状态的不平衡，即氧化应激。Nrf2是氧化应激中的关键转录因子之一，在抗炎症、抗细胞凋亡、抗肿瘤及调节细胞功能等方面具有重要作用。正常状态下，Nrf2处于稳定非活化状态表达于细胞质中，当细胞处于氧化应激状态时，Nrf2易位到细胞核中并增强下游靶基因的表达，包括醌氧化还原酶1（NQO1）和超氧化物歧化酶（SOD）等[9]。本实验结果显示，与对照组相比，HgCl2组小鼠MDA含量升高，而GSH含量和一些重要的抗氧化酶如GSHPx和T-SOD的活性降低，加快细胞膜脂质过氧化过程。这种变化促使逆转录因子Nrf2蛋白表达下调，从而抑制NQO1蛋白的表达。血清中ALT和AST水平是检测肝功能异常最重要的指标，HgCl2组小鼠血清ALT和AST均显著高于对照组。以上结果表明HgCl2导致小鼠肝脏氧化应激增强，抗氧化能力下降，最终引起肝功能受损。

内质网是细胞内一种重要的多功能细胞器，当内质网内的通路受到干扰，可导致未折叠和错折叠的蛋白质过度累积，即内质网应激。其中，GRP78是ERS的重要传感器，CHOP是ERS诱导细胞凋亡的关键蛋白。在ERS发生时，高水平的GRP78促使CHOP也表达升高，诱导细胞凋亡[10]。本课题组之前的研究发现，HgCl2所致的毒性损伤与ERS有密切的关系：HgCl2暴露引起ERS相关蛋白GRP78、CHOP表达增高并呈浓度依赖，而使用ERS的特异阻断剂4-PBA预先处理可明显降低GRP78、CHOP表达，同时降低Cleaved caspase-3的表达，减少细胞凋亡[11]。据报道，氧化应激可上调相关蛋白CHOP、GRP78的表达和Caspase-12的激活，促使ERS参与重金属中毒致的细胞凋亡[12]。在本研究中使用ERS特异性阻断剂4-PBA预处理组血清ALT和AST活性显著低于HgCl2组，肝脏MDA水平降低，GSH水平、SOD和GSH-Px活性升高，而且Nrf2/ NQO1蛋白表达增强并向核内易位。表明在HgCl2诱导的小鼠肝脏损伤模型中，ERs的特异阻断剂4-PBA可促使Nrf2/NQO1蛋白表达上调，发挥抗氧化的作用，保护肝脏损伤。4-PBA，作为内质网应激的特异性阻断剂，通过何种机制也影响到氧化应激，内质网应激和氧化应激之间存在何种关联，这是我们下一步研究的方向。

综上所述，汞暴露引起小鼠氧化应激，与Nrf2/NQO1通路密切相关，提前给予4-PBA可明显减轻HgCl2诱导的小鼠肝脏氧化应激，改善肝功能，表明4-PBA可能减轻汞暴露引起的氧化应激。