乔松素对肠缺血/再灌注小鼠发挥肠黏膜保护作用

艾世鹏，胡选亚，王胜文

（南阳市第一人民医院肛肠科，南阳 473001）

肠缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤是与急性肠系膜缺血、烧伤、败血症和失血性休克等临床紧急情况密切相关的病理生理过程，具有高发病率和高死亡率特点[1,2]。肠I/R不仅会引起肠道局部损伤，还会导致远处器官的多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）甚至多器官功能衰竭（multiple organ failure，MOF），最终导致死亡[3,4]。

乔松素（pinocembrin, Pin）是蜂胶、蜂蜜和一些植物（如生姜根和牛至属植物）中含量较高的5，7- 二羟基黄烷酮类化合物。有研究报道[5]发现，Pin通过抑制NF-κB抑制蛋白α（inhibitor of NF-κB-α，IкBα）、p38-促丝裂原活化蛋白激酶（p38-mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）的磷酸化水平来减轻肺损伤模型的炎症反应。此外，Pin对脑I/R大鼠模型具有抗海马炎症、抗氧化和抗凋亡的作用[6]。然而，Pin在肠I/R中发挥的作用及其机制尚不清楚。因此，本研究旨在观察Pin在小鼠肠I/R损伤中的作用与机制。

材 料 与 方 法

1 主要试剂

Pin（纯度＞ 99%）购自武汉科斯坦生物科技有限公司；小鼠IL-1β ELISA试剂盒、小鼠TNF-α ELISA试剂盒、TUNEL凋亡检测试剂盒、RIPA试剂、BCA蛋白定量试剂盒、ECL化学发光试剂盒、β-actin一抗和辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗均购自上海碧云天生物科技有限公司；二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、 谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒均购自南京生物建成研究所；兔抗Cleaved caspase-3、兔抗occludin、兔抗ZO-1、兔抗p38 MAPK和兔抗MAPK均购自英国Abcam公司。

2 实验动物和方案

40只6～8周雄性 C57BL/6 小鼠（体重22-25 g）购自华中科技大学动物实验中心【SCXK（鄂）2016—0009】。实验前让小鼠适应环境一周。将小鼠随机分为假手术（Sham）组、肠缺血再灌注模型（I/R）组、低剂量乔松素（15mg/kg）治疗（I/R+Pin15）组和高剂量乔松素（45mg/kg）治疗（I/R+Pin45）组，每组10只小鼠。在建立肠I/R模型前，小鼠禁食8h。按照文献[7]方法构建肠I/R模型：麻醉小鼠，并分离出肠系膜上动脉（superior mesenteric artery，SMA），用无创伤性微血管钳将SMA钳夹30min，然后松开血管钳以恢复SMA血流灌注。取下钳再灌注6h。Sham组除不进行I/R外，其余同I/R组。在乔松素治疗组中，在构建肠I/R模型前2h，按照15mg/kg或45mg/kg的剂量通过尾静脉将将乔松素注射小鼠体内，然后按上述方法进行肠I/R手术。

3 标本收集

在再灌注后6h麻醉小鼠，收集心尖血，并分离血清备用；处死小鼠，并从每只小鼠的相同位置——距回肠末端5cm处截取约10cm的肠段，将其中2cm的肠段用4%多聚甲醛固定24h，常规包埋于石蜡，用于形态学检测；其余的8cm肠段保存在-80℃下备用。

4 组织病理学

将石蜡包埋的回肠组织切成4μm厚的切片，行常规HE染色，光学显微镜下观察小肠组织形态并随机选取视野拍摄图像。20×物镜下，每个切片任选3个非重合随机视野下的图像，按照文献[8]方法，采用Chiu分级评分系统对每个视野下图像进行肠粘膜损伤程度评分。评分标准： 0，粘膜层完整；1，轻度粘膜萎缩，坏死和出血，轻度中性粒细胞浸润，粘膜层完整；2，中度黏膜萎缩，坏死和出血，中性粒细胞浸润中等，黏膜层完整；3，严重的黏膜萎缩，坏死和出血，中度大量中性粒细胞浸润和黏膜层受损；4，广泛的粘膜坏死和出血，中性粒细胞浸润完成，粘膜层消失。每只小鼠统计4～5张切片，取平均值，代表每只小鼠肠粘膜组织的Chiu积分。Chiu积分越高代表肠粘膜损伤程度越严重。

5 血清DAO、MPO、GSH-Px、SOD活性和肠组织炎症因子、MDA含量检测

取各组小鼠的血清，按照DAO活性检测试剂盒说明书步骤，用紫外比色法检测血清中DAO活性。

取各组小鼠冻存的肠组织（0.1g），在冰上用0.9mL生理盐水匀浆15min，1000r/min离心5min收集上清液。用BCA法测定蛋白含量后，分别根据对应的试剂盒说明书步骤，用ELISA法检测TNF-α和IL-1β水平，用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法检测匀浆液中MDA水平，比色法检测MPO和GSH-Px活性，用WST-1法检测SOD活性。然后，根据标本蛋白含量将TNF-α、IL-1β和MDA水平以及MPO、GSH-Px和SOD活性换算为单位mg蛋白中TNF-α、IL-1β和MDA水平以及MPO、GSHPx和SOD活性。

6 TUNEL分析

根据说明书步骤，将5μm厚的肠段在二甲苯中脱蜡并通过梯度降酒精进行水合；用20mg/ml蛋白酶K孵育20min，并在含20mg/mL蛋白酶K的TBS（10mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl；pH7.4）中冲洗；将切片与平衡缓冲液孵育30min，用TBS冲洗；在37°C的湿润环境中将切片与TdT酶孵育90min；随后用封闭缓冲液孵育30min。使用DAB显示标记，用苏木素进行复染。将切片脱水、透明封固后，光学显微镜下观察并随机选取视野拍摄图像。20×物镜下，每张切片选4个非重合随机视野下的图像，用Image J软件量化每个视野下图像的TUNEL阳性细胞比例。每只小鼠统计4个切片，取平均值，代表每只小鼠肠粘膜组织中TUNEL阳性细胞比例。

7 蛋白质免疫印迹

取各组小鼠冻存的肠组织（0.1g），在冰上用RIPA匀浆30min，1.0×105r/min离心12min收集上清液。用BCA法检测各样品的蛋白浓度。每样品取35μg蛋白行SDS-PAGE电泳。电转膜后，室温下用5%脱脂乳封闭PVDF膜上蛋白30min，然后分别孵育兔源一抗[occludin（1:2000）、ZO-1（1:3000）、Cleaved caspase-3（1:800）、p38 MAPK（1:4000）、p-p38 MAPK（1:1000）和β-actin（1:10000稀释）]1.5h，TBS-T（10mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，0.05% Tween-20；pH7.4）洗膜3次后，室温孵育HRP缀合的山羊抗兔IgG（1:2000）二抗45min，TBS-T洗膜3次后，用ECL化学发光试剂盒对目的条带显影，用AlphaView软件测量蛋白条带的光密度（OD）值。计算目的蛋白OD值与内参蛋白β-actin OD值的比值，以假手术组OD值比值为100%，归一化各实验组OD比值。

8 统计学分析

实验中所得的数据用均数±标准差表示，采用SPSS 19.0统计软件进行分析，多组之间比较采用单因素方差分析；P＜0.05被认为差异具有统计学意义。

结 果

1 乔松素抑制肠缺血/再灌注肠组织的病理损伤和血清DAO活性上升

HE染色显示，Sham组小肠组织绒毛和肠壁正常；I/R组表现为肠道绒毛缩短、绒毛上皮缺失、多处糜烂、炎性细胞浸润、坏死和肠壁出血；I/R+15mg/kg Pin 和I/R+45mg/kg Pin组肠粘膜损伤均明显改善（图1A）。对肠组织进行Chiu评分显示，与Sham组相比，I/R组肠粘膜组织学评分明显增加；与I/R组比较，I/R+15mg/kg Pin 和I/R+45mg/kg Pin组肠粘膜组织学评分明显降低（图1B）。除此之外，与Sham组比较，I/R组血清DAO活性显着升高；与I/R组比较，I/R+15mg/kg Pin 和I/R+45mg/kg Pin组血清DAO活性明显降低（图1C）。

图1 各组肠组织的病理变化以及血清DAO活性分析。A，小肠HE染色的代表图像；比例尺，50μm。B，肠粘膜的组织学评分统计学分析。C，血清DAO活性统计学分析。###，与Sham组相比， P＜0.001；与I/R组相比： **，0.001＜P＜0.01；***P＜0.001；n =10Fig.1 Analysis of the pathological changes of intestinal tissues and serum DAO activity in each group. A,representative HE staining images of the intestinal tissues; scale bar, 50μm;B, statistical analysis of Chiu scores of the intestinal mucosa; C, statistical analysis of serum DAO activity.###, P＜0.001 vs Sham group; **,0.001＜P＜0.01; ***, P＜0.001 vs I/R group; n=10

2 乔松素抑制肠缺血/再灌注肠组织中细胞凋亡和TNF-α和IL-1β的升高

TUNEL染色显示，I/R组肠组织中凋亡细胞数较Sham组明显增加， 15mg/kg和45mg/kg 乔松素处理可显著减少I/R所致的肠组织凋亡细胞的增加（图2A、B）。ELISA分析表明，与Sham组比较，I/R使小鼠肠组织中TNF-α和IL-1β水平显著升高，两种剂量的乔松素处理可显著抑制I/R所致的TNF-α和IL-1β水平升高（图2C、D）。

图2 各组肠组织中细胞凋亡以及TNF-α和IL-1β水平检测。A，小肠TUNEL染色的代表性图像； 比例尺，50μm。 B，TUNEL阳性细胞数统计学分析。C，IL-1β水平统计学分析。D，TNF-α水平统计学分析。###，P＜0.001 vs假手术组；与I/R组相比： **，0.001＜P＜0.01; ***，P＜0.001；n=10Fig. 2 Assay of the level of apoptosis, TNF-α and IL-1β in intestinal tissues in each group. A, representative TUNEL staining images of intestinal tissues; scale bar, 50μm; B, quantitative analysis of TUNEL-positive cells; C, IL-1β level; D, TNF-α level. ###P＜0.001 vs Sham group; **P＜0.01,***P＜0.001 vs I/R group; n=10.

3 乔松素抑制肠缺血/再灌注肠组织中MDA和MPO的升高与SOD和GSH-Px的降低

如图3所示，与Sham组比较，I/R组肠组织中MDA水平和MPO活性均明显升高，而SOD和GSHPx活性均明显降低；与I/R组比较，I/R+15mg/kg Pin和I/R+45mg/kg Pin组肠组织中MDA水平和MPO活性均明显降低，而SOD和GSH-Px活性均明显升高。

图3 各组肠组织中SOD（A）、MDA（B）、MPO（C）和GSH-Px（D）水平或活性检测。###，与Sham组相比，P＜0.001；与I/R组相比：**，0.001＜P＜0.01；***，P ＜ 0.001；n=10Fig. 3 Detection of the level or activity of SOD (A), MDA (B), MPO (C) and GSH-Px (D) in intestinal tissues in each group. ###, P＜0.001 vs Sham group; compared with I/R group: **, 0.001＜P＜0.01; ***, P＜0.001; n=10

4 乔松素抑制肠缺血/再灌注肠组织中occludin和ZO-1水平降低与Cleaved caspase-3和p38 MAPK水平升高

Western blot检测显示： 在I/R组肠组织中，occludin和ZO-1水平较Sham组显著降低，p38 MAPK和Cleaved caspase-3水平较Sham组显著升高；与I/R组比较，I/R+15mg/kg Pin 和I/R+45mg/kg Pin组肠组织中occludin和ZO-1显著升高，p38 MAPK和Cleaved caspase-3水平显著降低（图4）。

图4 各组肠组织中occludin、ZO-1、Cleaved caspase-3、p-p38 MAPK水平Western blot检测。A，代表性的Western blot检测；B—E，occludin（B）、ZO-1（C）、 p-p38 MAPK/p38 MAPK（D）和Cleaved caspase-3（E）水平定量分析。###，与Sham组相比，P＜0.001；与I/R组相比：**，P＜0.01；***，P＜0.001；n=10Fig. 4 Western blot examination of the level of occludin, ZO-1, Cleaved caspase-3 and p-p38 MAPK in intestinal tissues in each group. A, representative Western blot detection; B to E, quantification of the level of occluding (B), ZO-1 (C), p-p38 MAPK/p38 MAPK (D) and Cleaved caspase-3 (E). ###,P＜0.001 vs Sham group; compared with I/R group: **, P＜0.01; ***, P＜0.001; n=10

讨 论

虽然，防治肠I/R损伤的药物颇多，但总体效果并不理想。因此，目前急需寻找新的有效的治疗肠I/R损伤的药物。Pin具有抗炎、抗氧化和镇痛作用[5,6]，提示其可能具有潜在的抗肠I/R损伤的作用。肠I/R损伤可破坏肠黏膜完整性并诱发肠黏膜屏障功能障碍[3,8]。因此，本研究进一步评估Pin是否对肠I/R损伤具有保护作用。DAO是存在于肠上皮绒毛细胞中的一种高活性的细胞内酶，当肠损伤后会释放入血液中，因此血中DAO活性可在一定程度反映肠黏膜损伤[9]。HE染色的Chiu评分、TUNEL阳性和Cleaved caspase-3的阳性表达直接反映肠黏膜损伤的程度。本研究通过检测上述指标显示，Pin能维持肠I/R后的肠黏膜完整性并能降低血中DAO活性和肠组织中细胞的凋亡。肠黏膜紧密连接蛋白的表达情况反映了肠黏膜屏障功能的完整性，而肠黏膜屏障功能缺陷的最主要特征正是紧密连接蛋白的降解[8,10]。本研究显示，Pin能提高肠I/R后紧密连接蛋白（occludin和ZO-1）的表达，提示Pin能维持肠I/R后的肠黏膜屏障功能。以上结果充分显示了，Pin能改善肠I/R造成的肠黏膜病理形态改变，保护肠黏膜结构和屏障功能的完整性，提示Pin是具有潜力的抗肠I/R损伤的防护剂。

氧化应激在I/R损伤的发生和发展中起关键作用。自由基的水平在再灌注过程中急剧增加，同时伴随着抗氧化酶活性的降低，而过量的活性氧的聚集反过会加剧肠组织损伤和炎性反应[9,11]。MDA是脂质过氧化作用的产物，其含量可反映体内过氧化作用的严重程度[12]。MPO是反映中性粒细胞浸润程度的指标[9,12]，而GSH-Px和SOD是重要的抗氧化因子[9,11,12]。本研究结果表明，肠I/R损伤时发生氧化应激的代偿失调，其中MDA和MPO含量均明显增加，而GSH-Px和SOD含量则明显下降；Pin预处理可逆转肠I/R损伤导致的上述氧化应激标记物的变化和白细胞浸润以及IL-1β和TNF-α促炎因子的表达，这些发现证明Pin在肠I/R中具有抗炎和抗氧化的作用。

肠I/R损伤的发生和进展机制非常复杂，其中p38 MAPK信号通路的激活可导致肠上皮细胞的凋亡和坏死，激活中性粒细胞并增加细胞因子和粘附分子的表达水平，从而加剧肠I/R损伤；而减弱p38 MAPK信号活性能减轻肠I/R损伤[13]。本研究结果表明，Pin能抑制肠I/R损伤小鼠肠组织中p38 MAPK的蛋白表达。因此，Pin对肠I/R后的肠黏膜的保护作用可能在一定程度上与其降低p38 MAPK信号活性相关。

总之，本研究结果显示，Pin预处理在治疗肠道I/R损伤方面具有一定的有益作用，包含维持肠黏膜结构和形态以及屏障功能的完整性，且这一作用可能与其抗炎、抗氧化和减弱p38 MAPK信号活性相关。