五个烟草野火菌株的生理小种鉴定

于爽，于洋,，乔婵，杨鹏九，刘琳，潘洪杏，崔晓，刘德育，孙剑萍，万秀清，郭兆奎，李若*

1 牡丹江师范学院生命科学与技术学院，牡丹江市爱民区文化街191号 157011；2 黑龙江省公司烟草科学研究所，哈尔滨市哈药路17号 150076；3 中国烟草总公司黑龙江省公司科技处，哈尔滨市地段街173号 150010

烟草野火病（Tobacco Wildfire）是危害烟叶生产的主要细菌性病害之一。我国自上世纪四十年代有报道记录以来，野火病已在国内所有烟区发生并逐步上升为主要病害之一[1]。野火病在烟草整个生育期均可发生，病菌侵染初始产生褐色水渍样小圆点，周围被宽的圆形黄色晕圈环绕。该黄色晕圈是病菌产生的野火毒素所致，此为野火病区别于烟草角斑病（Angular Leafspot of Tabacco）的主要特征。遇到阴雨连绵的适宜气候条件，野火病斑迅速扩大融合，对烟叶产量和质量常造成重大损失。

野火病致病菌为野火菌（Pseudomonas syringaepv. tabaci，Pta），为丁香假单胞杆菌属烟草致病变种。除侵染烟草外，人工接种还能侵染大豆、菜豆、番茄、辣椒、马铃薯、黄瓜、龙葵等植物。迄今为止，以长花烟和黄花烟为抗性鉴定宿主，野火菌至少存在4个生理小种，即0、1、2和3号生理小种[2-4]。其中，既不能侵染长花烟也不能侵染黄花烟但能侵染（不含任何抗野火基因的）普通栽培烟草的野火菌株归为0号小种；能侵染长花烟但不能侵染黄花烟的归为1号小种；能侵染包括长花烟、黄花烟等抗病烟草在内的所有已知烟草的归为2号小种；能侵染黄花烟但不能侵染长花烟的归为3号小种。

国际上，1955 年Heggestad等育成第一个抗野火菌0号小种的栽培品种 Burley21[5]。之后，Stavely和Skoog将黄花烟N. rustica pumila的0和1号野火菌小种抗性导入普通烟草[6]。虽然2号小种能克服已知所有烟草的野火病抗性，但烟草育种人员将长花烟和黄花烟来源的抗性聚合起来育成的品种则能减轻2号小种所产生病症的严重程度[4]。目前，国内烤烟主栽品种均感野火病，不排除有个别中等抗性栽培品种，但也主要是水平抗性，未明确报道有长花烟或黄花烟垂直抗性来源。国内烟草植保、育种人员前期主要以生理生化试验来鉴别野火菌[7]，以各烟区主栽品种作为鉴别宿主对野火菌进行生理小种划分，在抗野火病抗性遗传规律方面侧重较少[8-9]。本研究首次在国内开展了基于抗病遗传规律的烟草野火菌生理小种鉴定，为今后加快培育垂直抗性的抗野火病烟草和克隆烟草特异抗0号和1号小种抗病基因提供了重要基础。

1 材料与方法

1.1 材料

烟草材料黄花烟（宁安）（下文简称黄花烟）、长花烟、KRK26、Burley 21（B21）、Ky14、龙江911（LJ911）和Kutsaga E1（KE1）种子由黑龙江省烟草科学研究所高新技术室保存。其中，黄花烟为晾晒烟栽培种，KRK26为津巴布韦烤烟普通栽培品种（雄性不育杂交种），黄花烟和KRK26抗野火菌0和1号小种，KRK26抗性来源于黄花烟。长花烟为烟草野生种，B21为白肋烟普通栽培品种，长花烟和B21抗野火菌0号小种，B21抗性来源于长花烟。LJ911为黑龙江省自育主栽烤烟品种，KE1为津巴布韦烤烟普通栽培品种，LJ911和KE1均感野火菌各小种，作为感病对照品种。Ky14为白肋烟普通栽培品种，抗0号小种[10]。各烟草材料相关信息见表1。

表1 试验所用烟草材料Tab. 1 Tobacco materials used in tests

烟草野火菌ATCC11528订购自美国ATCC机构，作为0号小种标准对照[11]。野火菌株ZD、M109、D151和W11分别采集自黑龙江省肇东市、穆棱市、东宁市和宁安市。采集的菌株经涂板—挑选单克隆—菌落PCR鉴定等多轮循环纯化至无杂菌[12]。烟草角斑菌217为黑龙江省烟草科学研究所高新技术室保存，作为菌种鉴定对照菌株。

1.2 方法

试验采用黄花烟、长花烟等晾晒烟栽培种、野生种，以及B21、Ky14等白肋烟栽培种等开展接种试验，烟草材料的异质性会使试验结果均一性不高；又由于抗野火病烟草材料在接种高浓度、大剂量野火菌时因超敏反应（Hypersensitive Response，HR反应）产生的坏死斑与感病烟草上的野火病斑难于区分。本研究在田间及温室分别设计了1个和3个接种试验，力图采用具有不同优点的多个试验来交叉验证野火菌的生理小种分类。

1.2.1 野火菌的PCR鉴定

以烟草角斑菌217为阴性对照，以野火菌ATCC11528为阳性对照，参照张萌等[12]方法对收集的野火菌株进行菌液PCR验证，具体方法如下。取各野火菌株菌液10 µL，12000 r/min离心2 min，移去上清液后，菌体沉淀作为PCR扩增模板。烟草野火菌特异性鉴定PCR引物序列如下：上游引物：tabB1F：5’-ATTGAAGAAGCGTTCGAGCG-3’；下游引物：tabB1R：5’-GTTTCGGGTCGGCACGATTG-3’，扩增片段大小为709 bp。PCR反应体系加入Premix Ex Taq Hot Start Version 5 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1µL，用双蒸水补足反应体系至10 μL并混匀。PCR反应条件为，95℃ 5 min；95℃ 40 s，58℃ 40 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min，33个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 野火菌田间生理鉴定

2020年在黑龙江省烟草科学研究所宾西实验场大田种植了黄花烟、KRK26、长花烟、B21、Ky14、LJ911和KE1等7个烟草材料，每个材料种植20垄，每垄12株，株距0.5 m，行距1.15 m。对7个烟草材料接种了ATCC11528、ZD、D151、M109和W11等5个野火菌株。取出-80℃保存的野火菌株，在超净工作台中将野火菌液加入到500 mL LB液体培养基中，180 r/min，28℃震荡培养过夜。接种前用蒸馏水稀释至5 L，并加入表面活性剂Silwet L-77至终浓度0.01%。待烟草长至团棵期，用喷壶对田间烟草进行喷雾接种，每菌种接种2垄各烟草材料。两周后拍摄记录各烟草材料的病理表现，两周后叶片上出现坏死斑点且围绕宽的黄色晕圈的典型烟草野火病症状的即判定为感病。试验重复2次。

1.2.3 烟草对野火菌接种浓度的病理反应

参照Knoche等[11]的试验方法在温室中进行野火菌接种浓度梯度试验，具体方法如下。将ATCC11528等5个野火菌株用LB液体培养基28℃振荡培养过夜，摇起的菌液5000 r/min离心10 min，菌体沉淀用PBS溶液重悬洗涤，再次离心沉淀，并用PBS溶液重悬，配制成浓度为0.1 OD（约108CFU/mL）的悬液。以此浓度为起始浓度，用PBS溶液依次5倍稀释，制成12个浓度梯度。用1 mL规格注射器针头在叶片上穿刺，在小孔处用一手按住叶片上表面，从叶片下表面注射入菌液。待烟草长至团棵期，将5个野火菌株12个浓度的菌液注射到黄花烟、KRK26、长花烟、B21、LJ911和KE1等6种烟草材料上。其中每个菌株接种每个烟草材料的4株烟，每株烟接种顶部完全展开的2片叶，每片叶片上接种6个浓度的菌液，各浓度的接种位置随机。接种后1～10 d，每天观察记录叶片上出现的病斑数量。试验重复2次。设定每个菌株菌液的最低一个浓度为基准C0，以菌液浓度的对数值（以5为底，起始浓度为0对应实际浓度为C0）为横坐标、以时间（天数）为纵坐标，绘制不同烟草接种了不同菌株、不同浓度野火菌液后最早出现的病理反应时间与野火菌浓度的关系图。

1.2.4 基于病斑大小的野火菌定量评价

参照Cole等[4]的试验方法，稍作改动，在温室中进行野火菌无损伤接种试验，具体方法如下。ATCC11528等5个野火菌株28℃在LB液体培养基中振荡培养过夜后，用PBS溶液洗涤后再用PBS溶液制备成浓度为106CFU/mL浓度的菌液，作为接种液备用。打开与喷枪（Hansa Aero-pro 251，0.2 mm nozzle）连接的真空泵，向喷枪液体槽中加入菌液。在叶片下表面，喷枪喷嘴距叶面1 cm左右，喷射叶面，菌液在叶片内扩展达到直径约0.5 cm大小。待烟草长至团棵期，把5个野火菌株接种到黄花烟等6个烟草材料上。每菌种接种各烟草的2株烟，每株烟接种顶部完全展开的2片叶，每片叶接种4个点，在叶片上的接种位置随机。接种10 d后，测量病斑直径（测病斑两条互相垂直的直径，最终使用两条直径长度相乘再开平方值）。试验重复2次。用SPSS软件对数据进行统计分析。

1.2.5 同一片叶上的对比试验

五个野火菌株接种液的制备同上节（接种液浓度为106CFU/mL），野火菌接种操作同1.2.3节（针刺结合无针头注射）。待烟草长至团棵期，在温室中将ATCC11528等5个野火菌株接种到黄花烟等6个烟草材料上，每个烟草材料接种2株烟，每株烟接种顶部完全展开的2片叶，每片叶上接种5个菌株。接种10 d后，拍摄记录各烟草材料的病理反应。试验重复2次。

2 结果

2.1 野火菌的PCR鉴定

如图1所示，对收集的野火菌株进行PCR鉴定。PCR反应检测靶标为烟草野火菌特有的野火毒素合成基因tabB基因，因为烟草角斑菌（Pseudomonas syringaepv. angulata，P. S. angulata）不能产生野火毒素，故用其作为阴性对照。如图所示，包括阳性对照野火菌株ATCC11528在内的所有检测野火菌株均能扩增出与预设片段大小709 bp一致的单一条带。这表明所收集的菌株均为野火菌，这些菌株可用于后续接种试验。

图1 PCR鉴定野火菌Fig. 1 Identification of Pta using PCR

2.2 野火菌田间生理鉴定

表2总结了田间5个野火菌株在7种不同野火病抗性烟草上的病理反应，图2展示了大田野火菌接种试验的代表性图片（未展示阴性结果）。如表2和图2所示，所有5个野火菌株均能侵染感病对照烟草LJ911和KE1，2周后均能在它们的叶片上产生典型的野火病症即点状坏死斑且周围环绕宽的黄色晕圈（如图2“LJ911-D151”和“KE1-D151”两小图所示）。这表明整个试验系统正常。野火菌D151能感染感病烟草LJ911和KE1，但既不能使长花烟抗性来源的B21感病，也不能使黄花烟和黄花烟抗性来源的KRK26感病，这表明D151属于0号小种。ZD和M109既能感染感病野草，也能在B21上产生病斑（如图2“B21-ZD”和“B21-M109”），但不能感染黄花烟和KRK26，因此将野火菌ZD和M109归为1号小种。ATCC11528和W11既能感染感病野草，也能感染黄花烟和KRK26（如图2“NR-W11”、“NR-11528”、“KRK26-W11”和“KRK26-11528”），因此把野火菌ATCC11528和W11归为3号小种。这里，野火菌W11在黄花烟叶片上产生的野火病斑发生合并、蔓延，表明其具有比ATCC11528更强的侵染黄花烟的能力。另外，ATCC11528原本是作为0号小种标准对照从美国引进，但在本试验中却被判定为3号小种，与先前其他研究人员结果不一致[11]，而且后面的几个试验结果也把ATCC11528归为3号小种，具体结果详见下文。

图2 野火菌大田接种试验结果Fig. 2 Result of Field trial of Pta inoculation

表2 野火菌大田接种试验结果Tab. 2 Result of field trial of Pta inoculation

2.3 烟草对野火菌接种浓度的病理反应

参照Knoche等[11]的试验方法，在温室中进行的野火菌接种浓度梯度试验可以反应不同野火病抗性的烟草当接种不同浓度、不同小种野火菌株时所产生病理反应的差别。图3展示了5个野火菌株在6个烟草材料上不同接种菌液浓度与发生病理反应时间（坏死斑）之间的关系。菌液浓度由100～108CFU/mL的12个梯度组成（对应关系图中的菌液浓度对数值0，1，2，…，11），病害调查时间为10 d。每个野火菌-病理反应时间组合用4株烟，关系图中显示的数据点为首次出现病理反应的最低浓度梯度（1个以上浓度梯度同一天出现坏死斑，只显示最低浓度梯度数据），对应的病理反应时间为4株烟的均值（平均反应时间）。

图3 野火菌接种浓度与烟草病理反应时间的关系图Fig. 3 Relationship of Pta inoculation concentration and pathological response time of tobacco plants

如图4黄花烟和KRK26小图，野火菌株ZD、D151、M109在菌液浓度对数值4（约103CFU/mL）以下的低浓度梯度时，接种黄花烟和KRK26不能使其感病，说明三者归类为0号或1号生理小种。野火菌株ATCC11528和W11在低菌液浓度时仍可使黄花烟和KRK26感病，说明二者归类为2号或3号生理小种。如图4长花烟和B21小图，野火菌株ATCC11528、D151、W11在菌液浓度对数值4以下的低浓度梯度时（对于长花烟浓度对数值则相应为8，约106CFU/mL），接种长花烟和B21不能使其感病，说明三者归类为0号或3号生理小种。野火菌株ZD和M109在低菌液浓度时仍可使长花烟和B21感病，说明二者归类为1号或2号生理小种。如图4 LJ911和KE1小图，5个野火菌株在所有浓度梯度均能感染两种感病对照烟草。

综上所述，依据各野火菌株在抗性鉴别宿主上的病理表现，将D151归类为0号生理小种，ZD和M109为1号生理小种，ATCC11528和W11为3号生理小种。试验发现，各烟草材料展现了不同抗性水平。其中，长花烟对野火菌0号小种D151和3号小种ATCC11528和W11展现了强的抑制作用，表现为3个野火菌株在高浓度梯度106CFU/mL（相当于对数浓度值8）以下时，已不能出现任何症状。B21的0号小种抗性来自长花烟，但其抗性弱于长花烟，表现在3个野火菌株在达到浓度梯度103CFU/mL（相当于对数浓度值4）以下时，才不表现病理症状。其中，试验发现，黄花烟和KRK26表现出的对野火菌0号小种D151的抗性弱于长花烟，它们的抗性水平略高于B21。

2.4 基于病斑大小的野火菌定量评价

图4统计了5个野火菌株接种在6个烟草材料上所产生病斑的大小。野火菌D151在黄花烟和KRK26上产生小病斑（<0.2 cm2），在长花烟和B21上则不产生病斑或小病斑，说明D151属于0号小种。ZD和M109在黄花烟和KRK26上产生小病斑，在长花烟和B21上诱发大病斑，说明二者归类为1号小种。野火菌ATCC11528和W11在黄花烟和KRK26上诱发大病斑，在长花烟和B21上则不产生病斑或小病斑，说明二者属于3号生理小种。试验中ATCC11528仍表现出对黄花烟和KRK26强的侵染性。

图4 野火菌无损伤接种试验结果Fig. 4 Result of non-invasive inoculation of Ptas

M109表现出对黄花烟和KRK26的侵染，这使它类于能侵染目前所有已知抗性烟草的2号小种。另外，W11虽未在长花烟上产生病斑，但在同一抗源的B21上产生较大病斑。综合这些结果，参考上节浓度梯度试验结果，原因是不同抗性材料抗性水品不同，而本试验所用的接种浓度（106CFU/mL）偏高，也即对于长花烟这样抗性强的烟草采用此浓度适合，将此接种浓度用在黄花烟、KRK26和B21上则偏高。

2.5 同一片叶上的对比试验

如图5，把5个相同浓度（106CFU/mL）的野火菌株接种到6个烟草材料的同一叶片上，对比不同野火菌株在同一烟草材料上的病理反应。在黄花烟上，5个菌株均造成了病斑，但ZD、D151和M109的病斑仅局限于接种区域内，而W11和ATCC11528的病斑则突破接种区域并蔓延扩大；在KRK26上，5个菌株均造成病斑，但W11产生的病斑则发生明显蔓延扩大。这表明，野火菌W11和ATCC11528能克服黄花烟类抗源抗性，而ZD、D151和M109不能（尽管它们也造成病斑，可能是由接种浓度偏高造成，但坏死斑不发生扩散）。在长花烟和B21上，ATCC11528、D151和W11没有产生病斑（3个菌株在B21上只在接种部位产生褪绿现象），说明三者不能侵染长花烟和B21；而ZD和M109则能在长花烟和B21上造成较大病斑，说明二者可以突破长花烟类抗源的抗性。5个菌株在LJ911和KE1等两个感病对照烟草上均能产生典型野火病斑。综合以上结果，可以判定，D151属于野火菌0号生理小种，ZD和M109属于1号小种，11528和W11属于3号生理小种。本试验结果与上述几个抗性鉴定试验一致。

图5 野火菌接种对比试验Fig. 5 Comparative test of Pta inoculation

综合大田接种试验和温室接种试验，四个试验得到的5株野火菌生理小种分类情况基本一致，分类情况见表3。此处将ATCC11528归类为3号小种的原因将在讨论中具体论述。

表3 烟草野火菌生理小种分类Tab. 3 Race classification of Ptas

3 讨论

3.1 野火菌接种方法

烟草野火病抗性鉴定存在接种方法和接种结果判定方面的困难。如在大田中采用喷雾方法接种野火菌，由于自然环境下紫外线强、温湿度条件差，低浓度的菌液不易在烟草叶片上定殖就过早死亡。另外，在无伤口情况下野火菌只能通过叶面气孔侵入，侵染效率低，发病时间长，需2周时间才能出现病症。如在温室中采用针刺法接种野火菌，则难于控制接种量，同时，抗病烟草在高接种量情况下所表现出的超敏反应形成的坏死斑与野火病斑难于区分，造成结果判定困难。

考虑到这些情况，设计多个具有不同优点的平行试验，从多方面鉴定、验证野火菌的生理小种分类。首先，大田接种试验能模拟野火菌在自然条件下侵染烟草，也可避免损伤式接种（如注射）接种量过大的缺点。其次，接种浓度梯度试验反映了不同小种野火菌在不同抗性烟草上病理反应出现的时间与其接种浓度的关系，是对具有不同特征生理小种的验证试验。同时，该试验也有利于区分野火病斑和由超敏反应造成的坏死斑（由野火菌超敏反应产生的坏死斑常常表现为短时间内出现、坏死斑颜色发白且周围黄色晕圈较小或没有）：如果在高接种浓度梯度下（如对于长花烟106CFU/mL以上，对于B21 103CFU/mL以上）某野火菌株可以短时间内（1～2 d内）造成某烟草材料出现坏死斑，而在低浓度梯度下对该烟草材料长时间后却不出现任何病理反应（见浓度梯度接种试验），则能据此判定出现的坏死斑为超敏反应造成。无损伤接种试验则是在不产生创口的情况下，实现对接种试验所产生野火菌病斑大小的精确量化，是对大田试验这样的定性试验及造成创口的注射接种试验的较好补充。接种对比试验是在同一烟草材料的同一片叶上接种所有野火菌株，以更清晰地呈现各野火菌株的差异。

3.2 试验结果讨论

首先试验将收集的野火菌株用特异性分子标签进行多轮纯化，得到了纯的野火菌株，排除了其他杂菌干扰，这是进行下面接种试验的必要步骤（因为实验室培养条件下，即使有极少杂菌，其增殖速度也比野火菌快得多）。四个平行接种试验获得的五株野火菌生理小种分类的结果基本一致，即把野火菌D151归为0号小种，把ZD和M109归为1号小种，把ATCC11528和W11归为3号小种，试验中未检测到2号小种。综合几个实验结果来看，同为1号小种的M109比ZD毒力强，表现在能以更低接种浓度、更短时间内使长花烟类抗源发病（浓度梯度试验），同一接种浓度下使长花烟类抗源更早出现、出现更大的病斑（无损伤接种试验及接种对比试验）；同为3号小种的W11比ATCC11528毒力强，表现为能以更低接种浓度、更短时间内使黄花烟类抗源发病（浓度梯度试验），同一接种浓度下使黄花烟类抗源更早出现、出现更大的病斑（无损伤接种试验及接种对比试验）。从接种用烟草材料来看，长花烟表现出了对0和3号小种强的抑制能力；B21的抗性由长花烟而来，但其抗性水平相对长花烟减弱不少（浓度梯度试验及无损伤接种试验）。黄花烟与KRK26对0和1号小种的抗性水平与B21对0和3号小种的抗性水平相当。

与先前的研究结果对比，试验中发现原本引进作为0号小种对照的野火菌株ATCC11528[11]在多个试验中均表现出了对黄花烟类抗源的侵染能力（尽管其毒力弱于W11），这使它在本研究中被归为3号小种。这种情况类似3号小种的发现过程[4]，在本试验中有可能再次发生。这一结果，也会在后续烟草野火菌基因组测序试验中进一步验证。与先前的研究结果对比，大田接种试验中发现Ky14品种不抗野火菌任何小种，甚至比作为感病对照的LJ911和KE1病情更严重，这与先前研究中用其作为抗0号小种材料不一致[10]。与先前的研究结果对比[4]，本试验由于采用了野生烟（长花烟）、黄花烟栽培种（黄花烟）、白肋烟普通栽培烟草（B21），使得试验结果的匀质性受到影响，尤其表现在用同一接种浓度接种各烟草材料时，出现与其他几个试验结果不相一致的情况，如无损伤接种试验中野火菌M109的表现。参考浓度梯度接种试验结果，如用不同接种浓度接种不同烟草材料（但同一种烟草材料各野火菌株接种浓度相同），应能达到与其他几个试验相一致的试验结果。这也同时提示，在以后做抗病基因功能验证时，需要考虑到转基因烟草抗性水平很有可能并不能达到其抗性来源一样高的抗性的情况。

4 结论

由于目前国内尚未以国际通行的抗性鉴别宿主区分烟草野火菌生理小种，本文首次基于抗性遗传规律对收集的野火菌株进行了生理小种鉴定。通过野火菌大田接种、浓度梯度接种、无损伤接种及同一叶片上的对比试验等4个各具优势的平行试验，将收集的野火菌D151、ZD和M109、ATCC11528和W11分别鉴定为0、1、3等3个小种。这为下一步培育野火菌小种专化抗性烟草品种及克隆小种专化抗病基因提供了重要基础。