硃砂烟 基因表达模式及烟碱转化率分析

宋中邦，隋学艺，张谊寒，王亚辉，赵高坤，李勇，王丙武，刘加红，解燕，杨世波，顾华国*

1 云南省烟草农业科学研究院/烟草行业烟草生物技术育种重点实验室/国家烟草基因工程研究中心，昆明 650021；2 云南省烟草公司曲靖市公司，曲靖 655000；3 云南香料烟有限责任公司，保山 678000

栽培烟草（Nicotiana tabacum）是两个祖先绒毛状烟草（N. tomentosiformis）和林烟草（N. sylvestris）通过种间杂交形成的异源四倍体，其叶片生物碱谱与两个祖先种存在显著差异。大部分栽培烟草的绿色及衰老叶片中烟碱是主要生物碱，约占生物碱总量的90%～95%。绒毛状烟草在绿色及衰老叶片中均积累去甲基烟碱；而林烟草在绿色叶片中主要积累烟碱，但在叶片衰老过程中大部分烟碱转化为去甲基烟碱[1-2]。白肋烟“非转化株”（Non-converter）叶片的主要生物碱为烟碱，但其子代群体中约有20%单株能发生自发突变，烟叶内的烟碱通过去甲基酶的作用转化为去甲基烟碱，从而使去甲基烟碱成为烟叶中积累的主要生物碱之一，这样的突变株称为“转化株”（Converter）[3]。烤烟也会发生类似自发突变导致其烟叶主要累积去甲基烟碱，且突变株烤后烟叶表面呈现红色斑点，国外学者称为“Cherry-red”[4-6]，我国民间称之为“硃砂烟”。硃砂烟出现概率极低，有研究表明在538个单株中发现3株硃砂烟，概率仅为0.56%[5]。硃砂烟具有独特的“糯米香”，云南地区烟民抽吸水烟筒时会将硃砂烟叶作为调香原料。

烟碱去甲基酶催化烟碱脱甲基产生去甲基烟碱，目前烟草基因组中烟碱去甲基酶基因家族共有4个功能基因被克隆，分别为CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10、CYP82E21[7-12]。CYP82E21基因虽能编码具有活性的烟碱去甲基酶，但仅在花药中表达，不影响叶片去甲基烟碱含量[11]。研究表明白肋烟“转化株”中CYP82E5、CYP82E10基因对去甲基烟碱合成无明显贡献，而CYP82E4在白肋烟“转化株”受未知机制诱导高水平表达，是导致“非转化株”自发突变成“转化株”的关键基因[12]。“非转化株”中过表达该基因可以显著提高叶片烟碱转化率（nicotine conversion rate，NCR，去甲基烟碱/（烟碱+去甲基烟碱）×100%），而通过RNAi抑制转化株CYP82E4基因表达、转化株中CYP82E4基因突变均能导致烟碱转化率显著下降[9-10]。烤烟中CYP82E4基因表达水平极低，烟碱去甲基化反应主要由CYP82E5、CYP82E10催化。云烟87中CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10基因三突材料的叶片去甲基烟碱含量比对照下降约90%[13]。因碱谱类似白肋烟“转化株”，推测烤烟“转化株”（硃砂烟）中CYP82E4基因也可能被诱导高水平表达，导致其烟叶中主要累积的生物碱为去甲基烟碱。

硃砂烟作为一种自发突变材料，其突变概率可能受到品种、土壤、营养、生态等因素的影响。本研究对硃砂2号开展农艺、遗传、基因、化学等特征特性分析，可为今后进一步研究硃砂烟成因提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2019年在云南省烟草农业科学研究院玉溪研和试验基地发现云烟87部分单株烤后产生硃砂烟，留杈套袋自交收种获得硃砂2号种子。

1.2 方法

1.2.1 田间试验

2020年度硃砂2号在云南省烟草农业科学研究院玉溪研和试验基地进行品比试验，田间生产参考当地云烟87的配套措施。设3个小区，每个小区种植100株左右，打顶后随机选取10株调查农艺性状。烤后烟叶根据硃砂红色深浅程度人工分成浅红、中等红色、深红3组进行相关研究。硃砂烟比率=当炉硃砂烟叶重量/当炉烤后烟叶总重×100%。

1.2.2 定量PCR分析

分别在烟株田间生长的团棵期、现蕾期、打顶后3个时期对烟株中部叶片液氮取样后-80℃保存备用。提取总RNA，反转录获得cDNA第一链（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，Takara）。采用SYBR Green法（SYBR Green l Master Mix，Roche）对目标基因进行荧光实时定量PCR（qRT-PCR）分析（LightCycler 480，Roche），定量引物如表1所示。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.2.3 生物碱检测

烤后取中部烟叶用于化学成分检测，设6个生物学重复。生物碱检测：内标喹啉、去甲基烟碱购自Sigma-Aldrich公司，烟碱购自TRC公司，检测仪器为Bruker 450GC-300MS气相色谱-串联质谱仪（Bruker）。准确称取烟样0.5 g于50 mL离心管中，加入5 mL 10%的NaOH溶液，摇匀，浸泡15 min，加入20 mL含内标的萃取液，超声60 min，在离心机上5000 r/min离心5 min，取2 mL下层二氯甲烷清液过装有2 g无水硫酸钠的微孔过滤器后，用气相色谱-串联质谱仪分析[14]。

2 结果与分析

2.1 硃砂2号田间农艺性状及硃砂烟叶产出规律

国外有文献记载[4-6]，烤烟品种高转化株的烤后烟叶也呈红色，被命名为“Cherry-red”。2019年烤烟生产季在云南省烟草农业科学研究院玉溪研和试验基地发现云烟87部分单株烤后烟叶呈红色（图1），这种外观初烤烟叶在云南烟区长期存在，被烟农称为“硃砂”烟，因此推测“硃砂”烟叶即是“Cherryred”烟，将该资源命名为硃砂2号。2020年烤烟生产季，对硃砂2号和对照云烟87进行了品系比较试验。田间试验结果表明，硃砂2号田间长势强、烟株整齐度较高，株型、叶色、生育期等性状与云烟87基本一致。硃砂2号打顶株高130.2 cm，有效叶片数26.5，茎围10.0 cm，腰叶长宽分别为64.2 cm和30.5 cm，各项指标与对照云烟87相当（表2）。烘烤试验分5次采烤完毕，按每一炉烤后获得烟叶总质量及硃砂烟叶质量计算硃砂烟比率。根据图2所示，下部叶也有一定比率硃砂烟叶产生，随着叶位增高，硃砂烟比率迅速上升，最后一炉硃砂烟比率高达87.5%，整体硃砂烟产出率为64.3%。

图1 硃砂烟叶烤后表型Fig. 1 Cherry-red phenotype of Zhusha tobacco leaves

图2 不同烘烤阶段硃砂烟叶比例Fig. 2 The percentage of Zhusha tobacco leaves in different curing stages

表2 硃砂2号农艺性状Tab. 2 The agronomic traits of Zhusha2 tobacco

2.2 硃砂烟特征基因和化合物研究

生物碱分析表明，同田种植的云烟87烤后烟叶烟碱含量为1.59%，去甲基烟碱含量为0.09%，烟碱转化率为5.12%（图3）。硃砂2号烟叶的碱谱与云烟87不同，其主要生物碱为去甲基烟碱，颜色呈浅红、中等红色、深红的硃砂烟叶去甲基烟碱含量依次增加，分别为0.97%、1.25%、1.78%，对应的烟碱转化率分别为86.95%、90.86%、93.85%（图3）。硃砂烟叶烟碱含量显著低于云烟87，分别为0.15%、0.13%、0.12%（图3）。目前已知CYP82E2基因家族的4个成员能够编码具有功能的烟碱去甲基酶基因，为明确硃砂2号高烟碱转化率的原因，利用qPCR分析了鲜烟叶中上述基因的表达水平（图4）。CYP82E21在云烟87和硃砂2号中均不表达，CYP82E5、CYP82E10表达水平在硃砂2号中更低。云烟87中CYP82E4不表达，但该基因在硃砂2号中高水平表达，可能是硃砂烟高烟碱转化率的内在原因。

图3 硃砂烟叶生物碱谱Fig. 3 Alkaloid profile of Zhusha tobacco leaves

注：误差线代表6个生物学重复，*表示与对照云烟87相比差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 硃砂烟不同生育期CYP82E4基因表达模式及烟碱转化率分析

为明确硃砂2号生长过程中CYP82E4基因表达水平变化及其导致的碱谱变化规律，采集团棵期、现蕾期、打顶后大田植株的中部烟叶进行分析（图5）。各时期云烟87样品中均未检测到CYP82E4基因表达，但硃砂2号中CYP82E4基因随着烟株生长发育水平逐步上升。云烟87中烟碱转化率在不同生长时期无明显差异，而硃砂2号烟碱转化率在不同时期均显著高于云烟87，且随着生长发育逐步上升，与CYP82E4基因表达水平变化趋势一致（图5）。

图5 全生育期CYP82E4基因表达模式及烟碱转化率分析Fig. 5 The CYP82E4 expression pattern and NCR during different growth periods

2.4 硃砂烟遗传稳定性分析

硃砂2号套袋自交收种后在漂浮盘播种，苗期随机选择单株进行CYP82E4基因表达水平分析及生物碱检测（图6）。云烟87叶片中无法检测到CYP82E4基因表达，但所有硃砂2号样品的CYP82E4基因高水平表达。相比之下，所有硃砂2号样品的烟碱转化率均远高于云烟87。上述硃砂2号单株烤后烟叶均呈现明显的硃砂特征，表明硃砂烟可以稳定遗传。

图6 CYP82E4基因表达水平及烟碱转化率分析Fig. 6 Analysis of the CYP82E4 expression level and NCR

3 讨论

栽培烟草中的去甲基烟碱含量通常低于总生物碱的5%，然而在白肋烟“转化株”中，烟碱被大量转化为去甲基烟碱，使后者比例可高达95%。通过比较“转化株”和“非转化株”叶片基因微矩阵[15]差异，发现CYP82E2基因家族基因表达存在差异。基于RNAi沉默CYP82E2基因家族基因和酵母异源表达实验发现CYP82E4基因为烟碱转化为去甲基烟碱的重要基因[12]。根据qPCR结果，栽培烤烟品种云烟87烟叶中CYP82E4基因表达水平极低，往往低于检测限。相比之下，硃砂2号中CYP82E4基因被诱导表达，从而导致烟叶中烟碱大部分被转化成去甲基烟碱。这与白肋烟中CYP82E4基因被诱导表达，导致“非转化株”向“转化株”转化相似。

硃砂烟和白肋烟“转化株”子代中CYP82E4基因仍保持高表达，表明该性状能稳定遗传，但烤烟和白肋烟中诱导CYP82E4基因高表达的机制尚不明确。据统计，烤烟品种自然条件下，自发突变产生硃砂烟的概率约为0.56%，远低于白肋烟“转化株”产生概率20%，这可能由烤烟和白肋烟基因组水平差异引起。Sanger测序表明普通烤烟、硃砂烟、白肋烟“转化株”、白肋烟“非转化株”的CYP82E4基因上游启动子2000 bp区域碱基序列完全一致（数据未发表），可以推测CYP82E4基因诱导表达与启动子DNA一级结构关联不大。因此，推测与白肋烟“转化株”形成相似，田间硃砂烟自发突变形成可能也受到表观遗传控制。CYP82E4基因诱导机理、白肋烟和烤烟中是否存在不同诱导机制需要进一步研究。

4 结论

硃砂烟基因及化学特征主要表现为烟碱去甲基酶基因CYP82E4被激活表达，导致去甲基烟碱成为主要生物碱，硃砂烟农艺性状与对照相比无显著差异，烤后烟叶硃砂红性状能够稳定遗传。