大豆与海藻有机肥对烤烟生长和土壤细菌群落的影响

褚德朋，陈芊如，邰振益，赵福彬，张鑫，张广雨，尹绍静，杜本林，贾海江，尚宪超，ILYAS Naila，尤祥伟，黄崇峻*，李义强

1 中国农业科学院烟草研究所，山东青岛崂山区科苑经四路11号 266100；2 山东青岛烟草有限公司，山东青岛市北区延吉路150号 266000；3 广西中烟工业有限责任公司，广西南宁西乡塘区北湖南路28号 530000

近年来，随着生态农业的逐步发展，我国烟田以施用无机化肥为主逐渐转向施用有机肥为主[1]。有机肥对于平衡烟叶烟碱含量和香吃味有重要的作用[2]。研究表明，长期施用有机肥可以增加土壤养分的有效性，提高土壤肥力[3]，提升土壤稳定性和缓冲能力[4]，还可促进细菌繁殖并调节土壤微生物群落的组成和多样性，使土壤微生物形成更多潜在功能群。Yan等研究发现，施用生物炭基肥料提高了Sphingomonas和Sphingobium等细菌丰度，它们与烟草香气呈正相关，可增加烟草香气成分，改善烟叶品质[5]。目前市面所售有机肥质量参差不齐，肥料效果差别很大。本试验旨在通过海藻肥、大豆肥的试验，筛选优化土壤结构、改善土壤生态、提高烟叶品质的有机肥种类及用量，以期为烟田土壤环境健康管理和烟草绿色发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2019年在山东省青岛市黄岛区六汪镇西台头村（东经119°44′18″，北纬35°57′16″）进行，试验地土壤为棕壤，pH 4.18，有机质15.94 g/kg，速效磷28.88 mg/kg，速效钾276.60 mg/kg，铵态氮0.0187 g/kg，硝态氮0.0309 g/kg。供试烤烟品种为当地主栽品种中烟100。按照烟叶生产实际肥料需求，施用烟草专用肥（N 10%、K2O 20%、P2O510%）450 kg/hm2，硫酸钾225 kg/hm2。市售普通有机肥（N+P2O5+K2O≥5、有机质≥65%）与大豆有机肥（N+P2O5+K2O≥8、有机质≥95%、蛋白质≥38%）均由青岛农特生物科技有限责任公司提供；海藻有机肥（N+P2O5+K2O≥5、有机质≥45%、海藻酸≥4%、有机钙≥10%）由青岛明月海藻集团有限公司提供。

1.2 试验设计

所用有机肥分别与常规氮磷钾复合肥和硫酸钾混合，条施后起垄。试验采用单因素随机区组设计，共设置8个处理（见表1），对照（CK）为常规施肥而不施有机肥处理，每小区3垄，每垄50株，重复3次，行株距为120 cm × 50 cm。试验过程中严格按照当地优质烟生产技术规范执行。烟苗于2019年4月28日移栽。

表1 试验处理Tab. 1 Experimental treatments kg·hm-2

1.3 测定内容及方法

1.3.1 农艺性状调查

团棵期各处理随机选取烟株5株，将地上部和地下部于茎基部分离，地下部用清水洗净泥沙晾干，分别称取两部分鲜重后放置于烘箱105℃杀青30 min，65℃烘干至恒重；旺长后期—现蕾期每小区选择有代表性10株烟，根据《烟草农艺性状调查测量方法》（YC/T 142—2010）进行农艺性状调查。

1.3.2 土壤样品采集及测定

于移栽后60 d左右进行土样采集，各处理均采用5点取样法采集0～20 cm土层，采用抖根法收集其根际土壤[6]；在根系周围2～5 cm的位置采集非根际土，将各处理采样点土壤等量混合，按四分法分为2份，1份放于-80 ℃保存，用于土壤微生物测定分析；另外1份风干后研磨过0.25 mm筛，进行土壤理化性质检测。土壤理化性质测定方法参照土壤农化分析标准检测方法[7]。

1.3.3 烟叶样品采集及测定

旺长后期每小区随机采集中部烟叶5～6片放入烘箱105℃杀青30 min，65℃烘干至恒重，粉碎后过20目筛。采用H2SO4-H2O2法消解，烟叶氮、磷、钾含量测定方法参照植物营养元素标准检测方法[7]。

1.3.4 高通量测序分析微生物群落

称取0.50 g土壤，使用DNeasy®PowerSoil®Kit（100）试剂盒提取DNA。参照文献[8]的方法使用引物341F（CCTAYGGGRBGCASCAG）和806R（GGACTACNNGGGTATCTAAT）以细菌16S rRNA基因的V3～V4区域为靶点，采用热循环PCR系统进行DNA扩增。1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。高通量测序文库的构建和基于Illumina MiSeq平台的测序由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

1.4 数据处理与统计分析

通过使用FLASH软件对Reads拼接过滤后得到优质序列，利用Uparse软件在相似性为97%的水平上，将序列聚类为操作分类单元（Operational taxonomic units，OTU）。通过对比silva 数据库（细菌），对OTUs序列进行物种注释及丰度分析，得到每个OTU对应的物种分类信息，揭示样品的物种组成，分析样品之间的微生物群落差异。采用WPS 2019计算原始数据的均值和标准差，并完成图表制作；采用SPSS 18.0统计软件Duncan法，比较分析相关数据在P≤0.05水平的差异显著性。

2 结果

2.1 不同处理对烤烟生长的影响

由表2可以看出，不同用量大豆有机肥和海藻有机肥的施用对烟株团棵期地上部和地下部的鲜重产生了明显影响。其中BOF30处理团棵期地上部和地下部的鲜重均较CK显著增加（P＜0.05），分别提高了131.39%和53.10%，而BOF20和BOF40处理与CK差异不显著（P＞0.05）；施用海藻有机肥的各处理，烟株团棵期地上部和地下部的鲜重与CK相比都有提高，但无显著差异。说明有机肥施用后烟株生长状况得到改善。

表2 不同试验处理团棵期地上部与地下部鲜重Tab. 2 Aboveground and underground fresh weight under different experimental treatments at the cluster stage

反映烟株长势的指标主要有株高、茎围、有效叶数、节距、最大叶长、最大叶宽和最大叶面积。由表3可知，施用大豆有机肥后，旺长后期—现蕾期株高、茎围、节距、最大叶长以及最大叶面积5项指标均高于CK，除茎围外其它指标与CK差异显著。有效叶数与最大叶宽的BOF30和BOF40处理分别与CK差异显著，与COF无显著差异；施用海藻有机肥后，旺长后期-现蕾期株高、茎围、节距以及最大叶长亦显著高于CK，WOF30的有效叶数和最大叶宽显著高于CK，较CK分别提高了15.58%、28.57%，但与COF差异不显著，最大叶面积除WOF20外其余处理均显著高于CK，且WOF30处理为最大值处理。综上所述，两种有机肥中施用量450 kg·hm-2的效果好于低用量（300 kg·hm-2）和高用量（600 kg·hm-2）。

表3 不同试验处理旺长后期-现蕾期农艺性状Tab. 3 Agronomic traits under different experimental treatments at the vigorous growing and flower budding stage

2.2 不同处理对土壤理化性质的影响

旺长期各处理土壤理化性质如表4所示。根际土壤中各处理pH、速效磷（Available phosphorus，AP）含量与CK均无显著差异；土壤有机质（Soil organic matter，SOM）WOF30处理较其他处理显著升高；BOF30处理土壤速效钾（Available K，AK）、铵态氮（Ammonium nitrogen，NH4+-N）以及硝态氮（Nitrate nitrogen，NO3--N）含量三指标与CK均差异显著，分别较CK提高了239.12%、46.48%以及216.13%。非根际土壤中BOF30和WOF30两处理土壤有机质和速效磷含量与CK无显著差异，但均呈升高趋势，COF处理土壤速效磷含量显著高于其他处理；土壤pH、速效钾和铵态氮含量三指标仅有BOF30处理与CK差异显著；土壤硝态氮含量各处理显著高于CK，增幅为222.37%～488.16%。

表4 不同试验处理旺长期土壤理化性质Tab. 4 Soil physi-chemical properties under different experimental treatments at the vigorous growing stage

2.3 不同处理对烟叶氮、磷、钾含量的影响

两种有机肥不同施用量对旺长后期烟草叶片氮、磷、钾含量具有不同程度的影响（表5）。与CK相比，施用不同量大豆有机肥和海藻有机肥处理的烟叶氮、钾含量均降低；烟叶磷含量WOF30处理显著高于CK，较CK提高了47.37%，其他处理与CK均无显著差异。

表5 不同试验处理旺长后期烟叶氮、磷、钾含量Tab. 5 Contents of N, P, K in tobacco leaves under different experimental treatments at the late vigorous growing stage %

2.4 不同处理对土壤微生物多样性和结构的影响

土壤细菌群落多样性分析结果显示（表6），根际土壤和非根际土壤中大豆有机肥和海藻有机肥施用后细菌群落丰富度和多样性均与CK无显著差异。此外，根际土壤大豆和海藻有机肥处理中除WOF30处理Chao 1指数、ACE指数高于CK外，其余均较CK降低，表明海藻有机肥施用后根际土壤中细菌群落丰富度升高多样性降低，而大豆有机肥施用后丰富度和多样性均降低。与CK相比，非根际土壤中WOF30处理Chao 1指数和ACE指数降低、香农（Shannon）指数和辛普森（Simpson）指数升高，BOF30处理Chao 1指数和ACE指数升高、香农指数降低，表明海藻有机肥施用后非根际土壤中细菌群落丰富度降低多样性升高，而大豆有机肥施用后丰富度升高多样性降低。

表6 不同试验处理根际和非根际土壤细菌群落多样性指数分析Tab. 6 Diversity index analysis of bacterial communities in rhizosphere and non-rhizosphere soils under different experimental treatments

不同试验处理根际与非根际土壤微生物属水平的群落组成及相对丰度如图1所示。分析根际土壤中不同细菌属的数量，表明其中优势细菌属包括（图1(a)）：Chujaibacter、Sphingomonas、Phenylobacterium、Rhodanobacter以及Bryobacter。与CK相比，五种优势菌群在BOF组中Chujaibacter和Bryobacter丰度降低，Sphingomonas、Phenylobacterium和Rhodanobacter丰度升高，然而WOF组中Chujaibacter和Bryobacter丰度升高，Phenylobacterium和Rhodanobacter丰度则降低，两组之间菌群变化趋势相反。非根际土壤中（图1(b)）的优势菌群则主要为Bryobacter、Chujaibacter、Acidibacter、Rhodanobacter以 及unidentified_Acidimicrobiia，与根际土壤大体一致。同CK相比较，Alicyclobacillus在BOF组中显著升高，且Dyella为该组的特有菌，其相对丰度分别为0.08和0.02。

图1 不同试验处理根际与非根际土壤微生物属水平的群落组成及相对丰度Fig. 1 The community composition and relative abundance of microbial genus levels in rhizosphere and non-rhizosphere soil under different experimental treatments

PCA主成分分析能够反映不同试验处理下烟株根际和非根际土壤细菌群落的变化情况。图2(a)为根际土壤细菌属水平上的PCA图，可知WOF与另外3组均差异明显，而BOF与CK、COF之间并未表现出明显差异，表明WOF的施用改变了烟株根际土壤的细菌群落结构，但BOF的使用并未明显改变。在PC1维度上，可以将WOF处理和其他3组处理分开，说明WOF处理与其他处理间细菌群落结构存在差异性。由图2(b)可以看出，在非根际土壤中PC1是造成样品差异性的最大主坐标成分，其次是PC2，分别解释了21.43%和15.72%的贡献率，两个主坐标轴总贡献率达37.15%。BOF和COF处理位于第1象限，CK和WOF处理位于第3象限，说明不同有机肥的施用改变了细菌群落结构。

图2 不同试验处理根际（a）和非根际（b）土壤细菌群落主成分分析（PCA）Fig. 2 Principal component analysis (PCA) of bacterial communities in the rhizosphere soil ( a) and non-rhizosphere soil (b) under different experimental treatments

选取单因素方差分析法基于属水平微生物的相对丰度分析各处理之间根际土壤和非根际土壤微生物的组成差异（图3）。分析发现根际土壤中Cutibacterium在CK和WOF以及BOF和WOF中差异显著，而Actinospica在COF和WOF中差异显著，且两种微生物在WOF中的丰度均高于另外3组；非根际土壤中Dyella和Pandoraea分别在CK和WOF以及BOF和WOF中差异显著，且两种微生物在WOF中的丰度低于对比组，然而Pseudonocardia在WOF中显著高于COF。综上所述，施用海藻有机肥后无论在根际土壤还是在非根际土壤中的细菌群落结构变化程度均大于其他处理组。

图3 不同试验处理根际与非根际土壤微生物属水平组间差异物种Fig. 3 Species difference between rhizosphere and non-rhizosphere soil microbial genus level under different treatments

2.5 不同试验处理土壤理化性质与土壤微生物的关系

图4分别估算了6种环境因子[pH值、NH4+-N、NO3--N、速效磷（AP）、AK和土壤有机质（SOM）]对根际土壤和非根际土壤中微生物在属水平上的相对贡献。结果表明，根际土壤中pH值、AK和NH4+-N是影响微生物结构的主要环境因子，pH值对Sphingomonas和Bryobacter有正相关作用，AK对Sphingomonas和Bryobacter有负相关作用，而NH4+-N对Sphingomonas和Bryobacter分别有正相关和负相关作用。非根际土壤中AK、NO3--N和NH4+-N则是影响微生物结构的主要环境因子，三者均对Bryobacter有负相关作用。

图4 不同试验处理根际（a）和非根际（b）土壤理化性质与土壤微生物的冗余分析Fig. 4 Redundancy analysis of physi-chemical properties and soil microorganism in rhizosphere soil (a) and non-rhizosphere soil(b) under different experimental treatments

3 讨论

本研究表明大豆和海藻有机肥的施用促进了烟株的生长发育，烟株团棵期地上部与地下部鲜重以及旺长期农艺性状都较CK显著增加，这与前人的研究结果一致。刘丽辉等[9]研究表明，不同施用量生物有机肥对烟草植株的农艺性状和光合色素含量的提高具有不同程度的促进作用；吕大树等[10]研究发现有机肥与无机肥配合施用，可以改善烟株的植物学性状和农艺性状，降低烟株发病率。本研究表明施用大豆和海藻有机肥后，根际土壤和非根际土壤的有机质和氮磷钾含量呈升高趋势，这与前人的研究结果一致。朱益等[11]、蒲全明等[12]研究表明，有机肥施入能改善土壤理化性质，减少养分向深层土壤流失、提高土壤中有机质的含量、提高养分的有效性，从而显著提高土壤速效养分的含量，且养分含量随有机肥比例上升而提高。氮、磷、钾与植物的物质合成和新陈代谢密切相关[13]。本研究表明，大豆和海藻有机肥施用后烟叶的氮、磷、钾含量与CK相比均降低，可能原因为大豆和海藻有机肥施用后促进了烟株的新陈代谢和物质合成，大量消耗氮、磷、钾，因而导致烟叶氮、磷、钾含量降低，具体原因还需进一步研究。

土壤微生物作为评价土壤的重要生物学指标，与土壤质量和土壤健康变化密切相关[14]。微生物群落结构和多样性、微生物生物量以及微生物活性作为常用的土壤健康微生物指标[15-16]，同时是评价土壤质量和土壤健康的关键指标[17]。随着生物技术的快速发展，土壤微生物群落结构和多样性在评价土壤健康方面的潜力被充分挖掘。本研究中，大部分处理根际土壤的细菌群落丰富度指数和多样性指数都高于非根际土壤，表现出了明显的根际效应。施用海藻有机肥使得根际土壤微生物群落丰富度升高多样性降低，非根际土壤与之相反；大豆有机肥施用后根际土壤微生物群落丰富度和多样性均降低，非根际土壤则丰富度升高多样性降低。可能原因为不同有机肥所包含的成分有所区别，不同细菌生活所需的营养物质也有差异，导致土壤中细菌对其响应出现差别，而且由于某些根系分泌物吸引有益微生物，抑制有害微生物，从而使土壤微生物群落丰富度和多样性出现变化。有研究已表明根系释放的各种分泌物可以选择性地刺激微生物种群生长，并可以为微生物提供营养来源，从而使微生物富集在根际土壤中，因此根际土壤微生物丰度和活性远高于非根际土壤[18]。本研究发现，根际土壤中Bryobacter、Sphingomonas、Actinospica以及非根际土壤中Pseudonocardia为主要有益菌。Bryobacter隶属于酸杆菌门（Acidobacteria），能够降解植物残体、参与单碳因子代谢且喜贫瘠的土壤，在增加土壤有机质和提高植物抵抗逆境能力等方面有重要作用[19-20]。Sphingomonas是促进植物生长的有益细菌，能够产生IAA并诱导根系生长，并且该菌与烟草香气呈正相关，可增加烟草香气成分[5]。Actinospica可通过调控土壤微环境从而提高植物对生长环境的适应能力[8]。Pseudonocardia参与土壤养分循环，并且与土壤碳、氮含量呈正相关，可促进烟草生长以及改善烟叶品质[5]。

4 结论

大豆与海藻有机肥对烤烟生长和土壤细菌群落的影响主要有：（1）两种有机肥提高了土壤有机质和氮、磷、钾含量，对团棵期、旺长期的农艺性状都有很好的促进效果，其中450 kg/hm2处理为最佳处理。（2）两种有机肥改变了土壤细菌群落的丰富度和多样性，Sphingomonas、Actinospica、Pseudonocardia等有益细菌丰度增加。