影响四川凉山地区烟草根结线虫病发生的关键因子分析

江其朋，江连强，龚杰，余佳敏，杨橙，刘东阳，王金峰，陈树鸿，李石力，杜娟，丁伟，王勇*

1 西南大学，植物保护学院，重庆 400715；2 中国烟草总公司四川省公司凉山州公司，西昌 615000；3 中国烟草总公司四川省公司，成都 610041；4 四川农业大学，玉米研究所，成都 611130；5 四川大学，生命科学学院，成都 610064

根结线虫病是由根结线虫（Meloidogynespp.）侵染引起的土传病害，严重危害作物根系，造成农作物减产[1]。20世纪80年代以来，根结线虫病逐步上升成为我国烟草上的主要病害之一[2]。目前，该病在我国主要烟区均有分布[3]，发病严重时可造成30%～50%烟叶产量损失，危害程度呈逐年上升的趋势[4]，对该病的监测预警和防治难度较大。研究表明，根结线虫病的发生发展与土壤的类型[5]、理化性质[6-7]、微生物数量和结构等因子有着密切的关联[8-10]。2020年，凉山州烟草根结线虫病发生面积超过3000 hm2，会理县发生尤为严重，部分感病烟田烟株死棵率超过80%，造成极大的经济损失和负面影响。本研究基于对四川省凉山州会理县烟草根结线虫病土壤数据的采集和分析，系统解析了土壤理化性质、微生物因子与烟草根结线虫病发生的相关性，旨在为凉山烟区根结线虫病的监测预警和防控技术研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

烟草根结线虫病发病和未发病土壤以及发病烟株根系采自四川省凉山州会理县黎溪镇新堰村。采样点为4块相邻但独立的发病和未发病烟田（共8块）。发病烟田前茬作物为玉米，未发病烟田前茬作物为小麦。种植的烟草品种均为中川208，采用统一漂浮育苗和田间管理，移栽时间为2020年5月2日，移栽后20 d田间烟株根系出现明显根结且烟株有一定矮化（5月22日），移栽后90 d，烟草线虫病害发生到达发病高峰期，烟叶采收后期（9月上旬），烟田根结线虫病发生趋于稳定，按GB/23222—2008《烟草病虫害分级及调查方法》国家标准调查根结线虫病发生情况，发病烟田根结线虫病发病率为95.00%，病情指数为94.78，未发病地块烟株无明显根结线虫病症状。

发病和未发病土壤样品采集时间为3月14日，为烟苗移栽和施肥前。采用5点取样法，每块烟田采集的5份样品混匀为1个重复，每个重复500 g，发病和未发病各4份土壤样品。发病烟株根系样品采集时间为6月30日，每块发病烟田采集3株发病烟株根系样品，共12份根系样品。样品详细信息如表1所示。

表1 土壤及感病烟草根系样品采集地理信息Tab. 1 Information of soil samples and root of infected tobacco

1.2 实验方法

1.2.1 土壤二龄线虫计数

分别称取挑除杂质的发病和未发病烟田土壤100 g，采用贝曼漏斗法对土壤中的线虫进行分离，并对二龄线虫（J2）进行计数。测定土壤含水量，计算100 g干土中二龄线虫数。

1.2.2 烟草根结线虫的形态学鉴定

采用直接解剖法，从病株根结中分离根结线虫雌虫和雄虫。将分离得到的根结线虫雌虫置45%乳酸溶液中，制备会阴花纹和雌虫虫体前部样本。将分离得到的根结线虫雄虫采用温热法杀死，用2.5%福尔马林固定液固定。将雌虫的会阴花纹、虫体前部、雄虫等挑到载玻片上制成临时玻片，在光学显微镜下进行形态学观察、拍照和测量，记录线虫群体口针长度（ST）、背食道腺开口到口针基部球的距离（DGO）、排泄孔到头端的距离（EP-HE）和口针基球圆宽高比（STKW/STKH），并对照已报道根结线虫的种类特征进行形态学种类鉴定。

1.2.3 烟草根结线虫的分子鉴定

采用浅盘法对根结线虫病发生烟株根系中的线虫进行分离[11]，采用离心法收集线虫，按照林伯荣等的方法提取样品线虫DNA[12]。采用PCR特异扩增方法对根结线虫种类进行分子鉴定，8种常见的根结线虫序列特异性扩增区标记的特异引物如表2所示，以南方根结线虫DNA为阳性对照。

表2 8种常见根结线虫鉴定特异性引物Tab. 2 Specific primers for identification of 8 kinds of common root-knot nematodes

25 μL PCR扩增体系：10×PCR Buffer 2.5 μL、5 U/μL Taq酶0.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL、20 mmol/L MgCl21.5 μL、10 μmol/L引物各1 μL、DNA模板2 μL，ddH2O补足至25 μL。

PCR扩增条件：95℃预变性5 min；94℃变性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃再延伸10 min，扩增产物于4℃保存。

扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，利用凝胶成像系统观测拍照。

1.2.4 土壤理化性质分析

土壤理化性质测定参照《土壤农化分析》[13]。土壤有效磷含量测定采用Olsen法，速效钾采用醋酸铵浸提-火焰光度法，交换性钙、交换性镁采用醋酸铵法，有效铜采用DTPA/HCl浸提-原子吸收光谱法。

pH采用电极法（水土比1:2.5）进行测定。称取10 g室温自然风干后过10目（2 mm）尼龙网筛的土壤样品于50 mL小烧杯中，加入25 mL超纯水，搅拌5 min，静置30 min，取上清液用pH计测定土壤溶液pH。

1.2.5 土壤微生物群落结构分析

采用土壤微生物DNA快速提取试剂盒（FastDNA Spin Kit，MP Biomedicals，美国）对土壤样品微生物总DNA进行提取。

将提取的土壤微生物总DNA进行PCR扩增建立测序文库。对细菌16S rRNA特异性V3～V4可变区进行扩增，上游引物为515F（5’-GTGCCAGCMG CCGCGG-3’），下 游 引 物 为806R（5’-GGACT ACHVGGGTWTCTAAT-3’）。对真菌ITS特异性可变区进行扩增，上游引物为ITS1F （5’-CTTGGTCA TTTAGAGGAAGTAA-3’），下游引物为ITS2R（5’-GCT GCGTTCTTCATCGATGC-3’）。

扩增结束后，采用Illumina MiSeq PE300平台进行测序分析，通过对原始测序数据获得样本中真实的序列信息ASVs（Amplicon Sequence Variant），基于ASVs代表序列信息和丰度信息，进行后续的物种分类学分析、群落多样性分析、物种组成分析。

1.2.6 数据统计分析和图表制作

利用Excel 2016进行数据整理；使用SPSS 17.0软件计算每组数据的平均值和标准误，并检验组间差异显著性；使用Origin 2019b进行绘图。

2 结果

2.1 会理县黎溪镇烟草根结线虫种类鉴定

对会理县黎溪镇分离的烟草根结线虫进行形态学观察和拍照，结果如图1所示，线虫ST值、DGO值和EP-HE值等测量参数如表3所示。雌虫会阴花纹背弓高、近方形、线纹平滑到波浪形，侧线不明显，侧区线纹有明显间断和分岔（图1b）。雌虫的会阴花纹、口针形态、ST值、DGO值、EP-HE值基本符合南方根结线虫的特征，初步鉴定为南方根结线虫（Meloidogyne incognita）。

图1 烟草根结线虫雌虫前体(a)、雌虫会阴花纹(b)和雄虫前体(c)形态Fig. 1 Morphology characteristics of female (a), perineal pattern(b) and male(c) of tobacco root-knot nematode

表3 烟草根结线虫雌虫群体测量参数Tab. 3 Parameter of female tobacco root-knot nematodes

进一步对黎溪镇采集的烟草根结线虫进行分子鉴定，结果如图2所示。经南方根结线虫特异性引物MiSF/MiSD扩增后，南方根结线虫DNA和检测样品DNA均扩增出约500 bp的条带，其他7种根结线虫特异性引物均未获得有效扩增条带，说明会理县黎溪镇烟草根结线虫种类为南方根结线虫。

图2 烟草根结线虫PCR扩增鉴定结果Fig. 2 PCR amplification results of specific primers of different tobacco nematodes

2.2 影响烟草根结线虫病的土壤理化因子分析

会理县黎溪镇烟草根结线虫病发病和未发病土壤二龄线虫数和理化性质检测结果表明（表4），烟草根结线虫病发病和未发病烟田土壤中均检测出二龄根结线虫，发病烟田100 g干土中二龄线虫数均值达312个，未发病烟田仅为106个。

表4 烟草线虫病发病与未发病土壤二龄线虫数和理化性质Tab. 4 Number of second-stage juvenile (J2) and soil physical and chemical properties of diseased soil and Non-disease soil

发病土壤理化性质数值与未发病土壤呈现出明显的差异。其中，发病土壤pH较未发病土壤低0.88（P<0.001）。同时，发病土壤的交换性钙、交换性镁、有效铜和有效硼含量分别较未发病土壤低71.76%（P<0.001）、80.90%（P<0.001）、52.25%（P<0.01）和52.50%（P>0.05）。

2.3 影响烟草根结线虫病的细菌群落分析

根结线虫病发病和未发病的土壤的细菌群落结构α多样性分析结果如表5所示。线虫发病土壤的细菌ASVs（Amplicon Sequence Variant）总数、Chao1指数和Shannon多样性指数均低于未发病土壤，表明发病土壤细菌群落的丰富度和多样性均低于未发病土壤，但仅Shannon多样性指数的组间差异性达到显著性水平（P<0.05）。

表5 烟草根结线虫病发病与未发病土壤细菌的Alpha多样性Tab. 5 Bacterial alpha diversity of tobacco root-knot nematodes diseased soil and Non-disease soil

线虫发病与未发病土壤细菌群落结构β多样性分析结果如图3所示。发病土壤共检测出3668个细菌ASVs，归类到28个细菌门，未发病土壤共检测出4735个细菌ASVs，归类到35个门，其中27个门（864个ASVs）为发病和未发病土壤所共有（图3a）。发病土壤的绿弯菌门（Chloroflexi）丰度显著高于未发病土壤，而发病土壤中的芽单胞菌门（Gemmatimonadota）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、Myxococcota、Nitrospirota和Methylomirabilota均 显著低于未发病土壤（图3b）。在属水平上，发病土壤中的类诺卡氏菌属（Nocardioides）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、Gaiella、Haliangium均显著低于未发病土壤（图3c）。

土壤理化性质和细菌群落结构的冗余分析结果表明，土壤交换性钙（R2=0.9133，P=0.015）、交换性镁（R2=0.9441，P=0.017）和有效铜（R2=0.7926，P=0.025）含量以及pH值（R2=0.9441，P=0.017）对整体土壤细菌群落的结构产生显著影响，同时，这4种关键的土壤理化性质对芽单胞菌属（Gemmatimonas）和类诺卡氏菌属（Nocardioides）有较高的正相关性（图3d）。

图3 烟草根结线虫病发病和未发病土壤细菌群落组成及其影响因子Fig. 3 Bacterial community composition of tobacco root-knot nematodes diseased soil and Non-disease soil and the influence factors

2.4 影响烟草根结线虫病的真菌群落分析

根结线虫病发病和未发病的土壤的真菌群落结构α多样性分析结果如表6所示。线虫发病土壤的真菌ASVs总数、Chao1指数和Shannon多样性指数均低于未发病土壤，表明发病土壤真菌群落的丰富度和多样性均低于未发病土壤，但仅Chao1指数的组间差异性达到显著性水平（P<0.05）。

表6 烟草根结线虫病发病与未发病土壤真菌的Alpha多样性Tab. 6 Fungal alpha diversity of tobacco root-knot nematodes diseased soil and Non-disease soil

根结线虫病发病与未发病土壤真菌群落结构β多样性分析结果如图4所示。发病土壤共检测出653个真菌ASVs，归类到10个真菌门，未发病土壤共检测出987个真菌ASVs，归类到12个门，其中9个门（260个ASVs）为发病和未发病土壤所共有（图4a）。发病土壤与未发病土壤中，子囊菌门（Ascomycota）均为丰度最高的真菌门，丰度超过80%。发病土壤的Basidiomycota门、镰刀菌属（Fusarium）和赤霉菌属（Gibbererlla）丰度均显著低于未发病土壤（图4b、图4c）。

土壤理化性质和真菌群落结构的冗余分析结果表明，土壤交换性镁（R2=0.9327，P=0.012）和交换性钙（R2=0.8920，P=0.016）含量以及pH值（R2=0.7914，P=0.027）对整体土壤真菌群落的结构产生显著的影响，同时，这3种关键的土壤理化性质与赤霉菌属（Gibbererlla）、镰刀菌属（Fusarium）、Ramophialophora和新赤壳属（Neocosmospora）具有较高的正相关性（图4d）。

图4 烟草根结线虫病发病和未发病土壤真菌群落组成及其影响因子Fig. 4 Fungal community composition of tobacco root-knot nematodes diseased soil and Non-disease soil and the influence factors

2.5 根结线虫与土壤理化性质和微生物群落的互作关系分析

土壤中二龄线虫数与土壤理化性质和细菌、真菌主要类群的相关性分析结果如图5所示。结果表明，交换性镁（R=-0.945，P<0.01）、交换性钙（R=-0.952，P<0.01）、有效铜（R=-0.977，P<0.01）含量和pH值（R=-0.865，P<0.01）与土壤中二龄线虫数呈显著负相关（P<0.01），相关性均高于0.86，有机质含量与二龄线虫数显著正相关（R=0.856，P<0.01，图5a）。细菌群落Chao1指数（R=0.656，P>0.05）、Shannon指数（R=0.688，P>0.05）和ASV数（R=0.077，P>0.05）与二龄线虫数正相关，但均未达到显著性水平。真菌群落Chao1指数与二龄线虫数显著负相关（R=-0.792，P<0.05），Shannon指 数（R=-0.632，P>0.05）和ASV数（R=-0.162，P>0.05）也与二龄线虫数呈负相关，但未达到显著性水平。

细菌群落芽单胞菌门（Gemmatimonadota，R= -0.865，P<0.01）、类诺卡氏菌属（Nocardioides，R=-0.729，P<0.05）、芽单胞菌属（Gemmatimonas，R=-0.766，P<0.05）、Gaiella（R=-0.902，P<0.01）和Haliangium（R=-0.870，P<0.01）的相对丰度与二龄线虫数呈显著负相关，而绿弯菌门（Chloroflexi，R=0.882，P<0.01）、Bryobacter（R=0.921，P<0.01）、Conexibacter（R=0.879，P<0.01）和 慢生 根 瘤 菌 属（Bradyrhizobium，R=0.912，P<0.01）与二龄线虫数呈显著正相关。真菌群落担子菌门（Basidiomycota，R=-0.792，P<0.05）、镰 刀 菌 属（Fusarium，R=-0.768，P<0.05）、Saitozyma（R=-0.723，P<0.05）和 赤 霉 菌 属（Gibberella，R=-0.851，P<0.05）与土壤中二龄线虫数呈显著负相关。

3 讨论

3.1 土壤微生物群落与烟草根结线虫病发生的关系

丰富度高、多样性强且处于动态平衡的土壤微生物区系能有效抑制土壤中病原微生物的数量和活性，减轻土传病害的发生[14-15]，而土传病害的发生往往与土壤微生物群落结构失衡有着密切关联[16-17]。研究表明，土壤改良能显著提高土壤微生物多样性，促进食细菌和食真菌类线虫的种类和数量，从而抑制植食性线虫的繁殖，实现对根结线虫病的有效控制[18-19]。本研究发现，烟草根结线虫病未发生土壤的细菌和真菌丰富度和多样性均高于发病土壤，这与祝明亮[8]和冀宇等[20]的研究结果相符。一些土壤微生物类群在整个抑病微生物群落中具有突出的地位，对根结线虫的生长和繁殖具有显著的抑制作用[21-22]。黄阔等对影响四川凉山地区烟草根结线虫病发生的微生物因子分析结果表明，假单胞菌属（Pseudomonas）与烟草根结线虫病发生呈负相关，Bryobacter、锥毛壳属（Coniochaeta）与烟草根结线虫病发生呈正相关[1,20]。本研究发现的可能具有抑制根结线虫病发生功能的关键微生物类群在根结线虫病未发病土壤中的相对丰度均高于发病土壤，且其相对丰度与土壤二龄线虫数呈显著负相关，其中，细菌类群芽单胞菌属（Gemmatimonas）、类诺卡氏菌属（Nocardioides）和真菌类群镰刀菌属（Fusarium）和赤霉菌属（Gibbererlla）等均未见报道，但芽单胞菌属（Gemmatimonas）[23]和赤霉菌属（Gibbererlla）[24]等曾多次被报道在烟草青枯病未发病的土壤中丰度更高，被认为可能与维护土壤健康有关[25]。因此，相关结论有待进一步研究确认。

3.2 土壤理化性质与烟草根结线虫病以及土壤微生物群落的关系

土壤pH[26]、交换性钙等土壤理化性质能塑造土壤微生物的群落结构[27]，对植物病害产生重要影响[28]。本研究和施河丽等[7]的研究均发现，烟草根结线虫病发病和未发病的土壤理化因子存在明显的差异，未发病土壤交换性钙和有效铜含量均显著高于发病土壤。吕和平等[29]的研究表明，土壤中添加含铜盐类物质对土壤中根结线虫卵囊、卵孵化及其幼虫存活均有不同程度的影响，这从侧面说明有效铜与根结线虫病的发生可能存在密切的关联。同时，本研究还进一步揭示了土壤交换性钙、交换性镁、有效铜和pH值与土壤中二龄线虫数呈显著负相关，且土壤理化因子显著影响土壤细菌和真菌的微生物群落组成和多样性，但对于土壤理化性质与二龄线虫以及土壤微生物的相互作用机制还有待进一步研究。

本研究探究的影响烟草根结线虫病发生的关键因子仅基于对会理县黎溪镇相关数据的分析，具有一定的局限性，后续需进一步开展相关验证研究，明确关键因子与病原根结线虫和根结线虫病发生的关系。

4 结论

本研究通过分析凉山州会理县发病土壤和未发病土壤的二龄线虫数、土壤理化性质和微生物群落组成，找到了影响烟草根结线虫病发生的关键因子。结果表明：（1）土壤交换性钙、交换性镁、有效铜和pH值含量偏低有利于烟草根结线虫病的发生；（2）土壤中细菌芽单胞菌属（Gemmatimonas）、类诺卡氏菌属（Nocardioides）、真菌镰刀菌属（Fusarium）和赤霉菌属（Gibbererlla）等微生物类群可能对烟草根结线虫和根结线虫病具有一定抑制作用。本研究为凉山烟区根结线虫病的监测预警和及时有效防控提供理论依据，后续可对这些关键因子开展进一步的验证研究，以明确其影响根结线虫病发生的内在机制。