电针足三里对小鼠术后肠麻痹及线粒体生物发生相关蛋白表达的影响

袁 伟，李岩松，杨亚男，张广建，刘 昌，王 强

(西安交通大学第一附属医院,陕西 西安 710061)

肠麻痹为术后肠道动力障碍相关疾病，是术后最常见的并发症之一，其中腹部相关手术引起肠麻痹发生的频率最高，障碍持续时间最长[1]。术后肠麻痹可延迟术后恢复，延长住院时间，增加病死率。目前对术后肠麻痹尚无疗效确切的西医疗法，多主张保守治疗，但效果并不明显。而大量涌现的中药疗法，鉴于术后肠麻痹患者常处于肠外营养支持状态，故不具有可操作性。针灸是祖国传统医学瑰宝，2016年中国中医科学院首席研究员、世界针灸学会联合会主席刘保延教授的研究团队的多中心、随机对照研究证实电针干预能够治疗便秘，改善肠动力[2]。以往研究证实氧化应激介导的线粒体功能障碍和核DNA损伤会导致不稳定的细胞氧化还原状态，这可能与腹部大手术后胃肠道动力不足有关[3-4]。鉴于此，本实验采用术后肠麻痹小鼠模型，基于线粒体功能探讨了电针对术后肠麻痹肠动力减低的保护作用及其机制，旨在为临床应用提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 雄性C57BL/6小鼠30只，体重18～25 g，空军军医大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK 2007-001。实验室内温度恒定在22～24 ℃，湿度恒定在55%～70%，保持动物实验室通风换气和整洁干净。

1.2主要试剂与设备 Nrf-1抗体、TFAM抗体、 COX-Ⅳ抗体(Genetex公司，美国)，HRP山羊抗兔 IgG( Genetex公司，美国)，JC-1 试剂液(Sigma，USA)，荧光显微镜(Olympus 公司，日本)，透射电镜(日立 H7500 TEM)，华佗牌SD-Ⅱ型电子针疗仪(苏州医疗用品有限公司)，DW2000动物人工呼吸机(上海益联科教设备公司)。

1.3实验方法 将30只C57BL/6小鼠随机分为假手术组、模型组、电针组，每组10只。参考文献[5]使用挤压法进行术后肠麻痹造模：术前12 h禁食禁水，腹腔内注射1%戊巴比妥钠35 mg/kg麻醉后，腹部正中切口约3 cm 进腹，假手术组仅打开腹腔；模型组和电针组将整个小肠放在潮湿的纱布垫上，用2个无菌湿润的棉花施用器对Treitz韧带到回盲部肠腔进行压迫，要求动作轻柔，不能触摸肠系膜，持续压迫15 min后将肠道放回腹腔中，并使用2层连续缝合线将切口封闭。小鼠术后在加热的恢复笼中进行麻醉恢复，在12 h内可以自由获取水和鼠食。术后24 h开始，电针组参考《实验针灸学》[6]选取双侧足三里穴(后肢胫骨粗隆外侧至踝间上1/5处，即腓骨头下约0.5 cm 处)进行电针干预，具体操作：用1%～2%异氟醚麻醉诱导后，以0.5%～0.8%异氟醚进行麻醉维持，采用2 Hz/10 Hz 疏密波、强度1 mA进行电针刺激，30 min/d ，连续5 d。

1.4检测指标及方法

1.4.1肠动力检测 ①结肠排珠时间：在肛门塞入直径为2 mm的玻璃珠，用定制的覆盖硅管的套管轻轻推入2 cm ，观察玻璃珠排出时间。②肠运输时间：小鼠灌胃100 μL伊文氏蓝甲基纤维素溶液，分笼饲养，笼中铺白布观察蓝色物质排出时间。以第1次出现蓝色粪便为终点，每只小鼠观察8 h。③排泄物分析：小鼠分笼饲养，收集小鼠10:00—11:00排泄物，称重，然后将排泄物放入60 ℃烤箱过夜后记录干重，计算粪便液体百分比，连续3 d记录均值。

1.4.2肠神经线粒体形态、数量和体积 取2 cm×0.5 mm回盲部远端2 cm处结肠，固定、脱水、包埋、固化后超薄切片机震动切片60 nm，进行铅铀染色，经半薄层定位在光镜下定位肠道环形肌和纵行肌之间的肠道神经节，薄层切片，使用透射电镜观察形态，采用点数法测量线粒体的结构参数，以细胞立体学定量法计算数密度、平均体积[7]。

1.4.3肠神经线粒体功能

1.4.3.1线粒体制备 将小肠置于冰水浴中，全程低温操作。组织匀浆后收集上清液， 4 ℃下800×g离心5 min，将上清液转移到新离心管，在4 ℃下12 000×g离心10 min，离心后的上清液含胞浆成分，线粒体即沉淀在管底，转移上清液。洗涤线粒体后加入0.2 mL Mito-Cyto Buffer重悬线粒体沉淀， 离心弃上清。用 Mito-Cyto Buffer反应缓冲液重悬线粒体沉淀，达到50 μL/100 mg 组织后测定蛋白浓度，或-70 ℃保存。

1.4.3.2线粒体膜电位检测 将各组线粒体悬液和JC-1工作液在37 ℃下孵育15 min,2 000 r/min 离心(离心半径13.5 cm)5 min,弃上清, 用缓冲液重新悬浮。采用激光共聚焦显微镜(Lecia Tcs SP2,Germen)观察线粒体膜电位变化。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，产生绿色荧光。通过荧光颜色的转变检测线粒体膜电位的变化。

1.4.3.3线粒体ATP含量测定 采用萤火虫荧光素酶催化荧光素发光法检测线粒体ATP含量,将ATP标准溶液用ATP检测裂解液按200，100，50，25，12.5，6.25，0 μmol/L 浓度梯度稀释，加100 μL到检测管内，加入10 μL荧光素酶溶液，以6 s发光强度积分值的对数为纵坐标，ATP浓度的对数为横坐标，制作标准曲线。在200 μL 反应介质中依次加入0.05 mg 线粒体和20 μmol/L萤光素酶，记录本底发光强度，然后加入4 μmol/L ADP启动反应，6 s后记录发光强度，根据标准曲线计算ATP含量。

1.4.4肠神经线粒体生物发生相关蛋白表达情况Western blot法检测Nrf-1、TFAM和COX-Ⅳ蛋白表达情况：取出制备好的组织标本，按说明加入适当裂解液和蛋白质抑制剂，冰上研磨匀浆，使用T hermo BCA 试剂盒进行蛋白定量。根据分子量大小，制备12%分离凝胶、5%浓缩胶，上层胶电压80 V、下层胶电压120 V电泳，300 mA恒流转膜2 h。封闭2 h后孵育一抗(Nrf-1，1∶500；TFAM,1∶2 000;COX-IV,1∶3 000;β-actin，1∶5 000)，4 ℃摇床中过夜，室温孵育二抗(羊抗兔，1∶10 000)2 h。ECL显色后曝光显影，以目标蛋白与β-actin的积分灰度值比值作为目的蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1各组小鼠肠动力比较 与假手术组比较，模型组小鼠结肠排珠时间、肠运输时间均明显延长(P均<0.05)，粪便干重明显降低(P<0.05)，粪便液体百分比明显增高(P<0.05)；与模型组比较，电针组小鼠结肠排珠时间、肠运输时间明显缩短(P均<0.05)，粪便干重增加(P<0.05)，粪便液体百分比减少(P<0.05)。见表1。

表1 假手术组和术后肠麻痹各组小鼠肠动力比较

2.2各组小鼠肠神经元线粒体形态 透射电镜下观察，假手术组小鼠线粒体大小基本正常，基质均匀，边界及结构清晰，线粒体的嵴致密饱满，未见明显的线粒体肿胀及空泡样改变；模型组小鼠线粒体数量明显减少，大小不一、无规律，形态不规整，排列不规则，边界不清，线粒体大部分有明显的肿胀和空泡样变性，基质不均匀，结构模糊，肿胀的线粒体嵴有较明显的断裂；电针组小鼠线粒体损伤明显轻于模型组。见图1。

图1 透射电镜观察假手术组和术后肠麻痹各组小鼠肠神经元线粒体形态(×4 000)

2.3各组小鼠小肠肌间神经丛肠神经元线粒体数量和体积比较 与假手术组比较，模型组小鼠线粒体数量明显减少(P<0.05)，线粒体体积明显增大(P<0.05)；与模型组比较，电针组小鼠线粒体数量明显增加(P<0.05)，线粒体体积明显缩小(P<0.05)。见表2。

表2 假手术组和术后肠麻痹各组小鼠透射电镜下肠神经元线粒体数量和体积比较

2.4各组小鼠线粒体膜电位及ATP含量比较 模型组小鼠线粒体膜电位及线粒体ATP含量均明显低于假手术组(P均<0.05)，电针组小鼠线粒体膜电位及线粒体ATP含量均明显高于模型组(P均<0.05)。见表3。

表3 假手术组和术后肠麻痹各组小鼠线粒体膜电位及ATP含量比较

2.5各组小鼠线粒体生物发生相关蛋白表达情况比较 模型组小鼠线粒体中Nrf-1、TFAM和COX-Ⅳ蛋白相对表达量均明显低于假手术组(P均<0.05)，电针组小鼠线粒体中Nrf-1、TFAM和COX-Ⅳ蛋白相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05)。见表4。

表4 假手术组和术后肠麻痹各组小鼠线粒体生物发生相关蛋白相对表达量比较

3 讨 论

术后肠麻痹指整个消化道的协调运动出现延迟，表现为不同程度的腹胀和肠鸣音消失，造成大量分泌物和气体聚集，出现恶心、呕吐、腹胀和腹痛等症状，重者可持续数天到数周，麻痹持续3 d以上进展为麻痹性肠梗阻，病死率剧增。术后肠麻痹还增加了患者医院获得性感染和深静脉血栓形成的风险，另外肠功能异常者免疫力下降，易导致细菌及内毒素移位，发生系统性炎症反应综合征，更严重者会出现多器官功能障碍，威胁生命。因此，改善术后肠麻痹有重要意义。

目前术后肠麻痹的发病机制并不明确，可能为多因素共同作用的结果，临床上缺乏行之有效的确切治疗方法，仍然是临床治疗的难点。中医认为术后肠麻痹属“腹胀”“肠结”的范畴，肠为传化之腑，司饮食之传化物，传化物而不藏，实而不满。气机运动主降，以通为用，腹部手术使脏腑气机逆乱，造成气滞血瘀，痞满不通，且手术耗伤津血，患者气血亏损，血脉空虚，无力推动气机运行。中医治法上强调“补正为先，稍佐疏导”，多采用补虚行气之中药方剂治疗，如补中益气汤、四君子汤、复方承气汤等[8]，但效果不理想，并且在循证医学的支持下，很多传统治疗术后肠麻痹的中药方法已被证实无效。

针灸疗法是中医学中重要而又独具特色的治疗疾病的方法，经过多年的经验总结，已经得出系统的理论体系。电针疗法源自于针灸疗法，且相对于针灸疗法具有可重复性。众多研究表明应用电针足三里治疗胃肠动力障碍具有不良反应少且疗效较好等优势。足三里为足阳明胃经的合穴，是调整胃肠功能的要穴，有疏通经络作用，并可调节脾胃之清浊、气机之升降、阴阳之协调而使大便自通，毒邪随之而去，同时具有扶正培元之功效。张立俭等[9]和王磊等[10]研究发现电针足三里通过调节胃肠激素分泌、改善胃肠黏膜的血液循环等多个环节改善胃肠道黏膜屏障。Ng等[11]研究报道，电针足三里、三阴交、合谷、支沟穴可缩短结直肠癌腹腔镜手术患者术后肠梗阻的持续时间。Hsiung等[12]报道，胃癌术后电针胃肠经的足三里穴及心包经的内关穴，能够明显缩短术后首次排气时间。 Liu等[13]随机对照研究证实，在全麻下进行肝脏和血管外科手术前电针内关、足三里、下巨虚，能明显缩短术后首次排气、排便时间及住院时间。本实验结果显示，电针能缩短术后肠麻痹小鼠结肠排珠时间和肠运输时间，增加粪便干重，降低粪便的干湿比，能够改善结肠动力及吸收水分的能力。

线粒体是机体能量的供应站，细胞活动所需要的能量的95%由线粒体氧化磷酸化产生的ATP提供[14]。线粒体的结构和功能不仅仅对细胞、乃至对整个机体的正常运转都具有重大意义。线粒体在多种疾病的发病过程中扮演着重要的角色，其正常形态及功能需要线粒体生物合成、线粒体融合分裂、运动和自噬的动态平衡来维持[15]。当线粒体受损时，线粒体生物功能发生障碍，导致细胞功能异常，影响机体器官及活动。 Chen等[16]研究发现，术后肠麻痹发生后，ROS含量和MDA含量增加，线粒体肿胀、变性，线粒体这种超微结构的退行性变化可能与胃肠动力障碍有关。另有研究证实，棕榈酸可通过线粒体损伤降低肠神经元细胞活力，其诱导的肠神经元丢失可能导致肠道运输延迟[17]，同时线粒体膜电位降低，ATP产生减少，呼吸复合物活性表达减少，解耦联增加，线粒体的抗氧化能力和线粒体DNA 含量也会减少，生物发生现象受影响[18]。本实验结果显示，术后肠麻痹模型组线粒体数量减少，纤维排列紊乱，肌丝断裂，线粒体肿胀、嵴断裂，其内部形成囊泡，线粒体膜电位和ATP含量较假手术组明显降低；电针组线粒体数量增加，形态改善，线粒体膜电位和ATP含量增加。说明术后肠麻痹可导致线粒体损伤，电针能够改善术后肠麻痹时线粒体能量代谢障碍。线粒体的生物发生是指线粒体的生长和分裂，包括核基因组编码的蛋白质的合成和转运、线粒体DNA 复制、线粒体基因组编码的蛋白质合成和核聚变裂变等过程[19]。线粒体生物发生相关蛋白分子Nrf-1、TFAM、COX-Ⅳ主要参与调节线粒体生物发生[20]，线粒体的生物发生现象目的是恢复线粒体功能。Nrf-1有诱导线粒体基因转录的作用，与编码呼吸亚基的基因启动子、线粒体转录因子TFAM和TFBs结合，共同调节线粒体转录，是调控线粒体电子传递链功能的关键因子。TFAM也是体内决定线粒体基因是否开始转录的关键调控因子，对线粒体生物发生和胚胎发育至关重要，并对线粒体 DNA 复制的数量、组装等过程起着调节作用。故上调 Nrf-1和TFAM有助于促进线粒体的生物发生。本实验结果显示，模型组Nrf-1、TFAM、COX-Ⅳ蛋白相对表达量明显低于假手术组,电针组Nrf-1、TFAM、COX-Ⅳ蛋白相对表达量明显高于模型组，提示电针可能通过促进线粒体生物发生而改善线粒体功能。

综上所述，电针可能通过上调肠神经元线粒体生物发生相关蛋白Nrf-1、TFAM、COX-Ⅳ的表达，改善线粒体能量代谢障碍而增强术后肠麻痹小鼠的肠动力。本研究不仅有助于深入探讨术后肠麻痹的发生机制，也为预防和治疗术后肠麻痹提供了新的思路及治疗靶点。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。