基于AMPK/SREBP-1c信号通路探讨益气健脾汤对非酒精性脂肪性肝病小鼠糖脂代谢的影响

杨 磊,袁星星,李 莹,王炳予,刘成祥,战晶玉,郭雪莹,刘长发

(1. 黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150006；2. 黑龙江省中医药科学院南岗分院，黑龙江 哈尔滨 150006；3. 黑龙江省中医药科学院三辅分院，黑龙江 哈尔滨 150036；4. 黑龙江省中医药科学院中药研究所，黑龙江 哈尔滨 150036)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)作为一种常见的临床病理综合征，以肝细胞脂肪变性、脂质蓄积和肝小叶内空泡形成为主要特征。根据超声表现可将NAFLD分为轻、中、重度，轻度患者可无任何临床症状，部分患者可感到体倦乏力、厌食油腻，中、重度患者可出现食欲不佳、恶心、呕吐、右上腹隐痛等临床症状[1]。NAFLD包括非酒精性肝脂肪变、非酒精性脂肪性肝炎及其在此基础上进展而成的肝纤维化、肝硬化及肝细胞癌[2]。一项2016年的流行病学调查结果表明，NAFLD已成为全球最常见的慢性疾病之一，普通成年人的患病率为6.3%～45%[3]，有效治疗NAFLD已被当代医学列为亟待解决的关键问题。益气健脾汤是治疗NAFLD的临床经验方，前期研究显示其具有抗炎、保肝、抑制脂质蓄积作用[4-5]，但是其改善NAFLD糖脂代谢的具体机制尚未明确。本实验拟通过检测肝脏组织中腺苷单磷酸活化蛋白激酶(AMPK)/固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)的表达情况，进一步探索益气健脾汤对肝脏糖脂代谢的调控机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 40只C57BL/6J小鼠，购自黑龙江省中医药科学院动物实验中心，许可证编号：SYXK(黑)2016-008。实验所有操作流程均严格按照实验动物相关规定进行。小鼠饲养环境：温度(24±2)℃，相对湿度为50%～70%，光照12 h明暗交替，常规喂养和自由饮水。

1.2实验药物 益气健脾汤，组方：生黄芪15 g、丹参10 g、三七5 g、女贞子8 g、墨旱莲8 g、西洋参10 g、泽泻10 g、生山楂10 g、荷叶10 g、绞股蓝5 g、生甘草3 g，各味药材购自黑龙江省中医药科学院南岗分院，加5倍量水浸泡，回流提取0.5 h，趁热过滤，药渣再加4倍水回流提取0.5 h，趁热过滤，合并滤液，浓缩至每1 mL含生药2.34 g的浓缩液备用。二甲双胍，购于黑龙江省中医药科学院，国药准字H20023370。三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、苏木素-伊红染液(HE)及油红O染液试剂盒购于南京建成生物工程研究所，货号分别为C009-2-1，C010-2-1，A112-1-1，A113-1-1，A042-1-1，A111-1-1，A110-1-1，H203，F006-1-1，D006-1-1，D027-1-1。AMPK抗体、p-AMPK抗体、SREBP-1c抗体、β-actin单抗和辣根酶标记的二抗购于Abcam公司，货号分别为ab79885，ab68206，ab28481，ab8226，ab6721。

1.3实验方法 所有C57BL/6J小鼠在实验开始之前适应性喂养1周，之后按照体重随机分为空白组、模型组、二甲双胍组和益气健脾汤组，每组10只。除空白组继续给予常规饲料喂养外，其他组均通过高脂饮食喂养构建NAFLD模型。常规饲料组成成分：玉米粉40%、豆饼29%、麸皮26%、骨粉1%、赖氨酸1%、食盐1%、维生素等，按照100∶12的比例加入蒸馏水；高脂饮食组成成分：84%基础饲料、10%猪油、5%蛋黄粉、1%胆固醇。造模周期为12周，造模期间小鼠自由饮水。从第9周开始，二甲双胍组给予二甲双胍100 mg/(kg·d)灌胃，益气健脾汤组给予益气健脾汤0.5 mL/d(生药浓度2.34 g/mL)灌胃，空白组和模型组给予0.5 mL/d蒸馏水灌胃, 给药剂量根据人与动物每千克体重剂量折算法计算[小鼠给药量(mg/kg)=折算系数W×人的给药量(mg/kg)],均灌胃4周。

1.4观察指标及方法

1.4.1血清生化指标 末次灌胃结束后禁食不禁水24 h，采用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后处死小鼠，收集腹主动脉血2 mL，离心取上清，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清TG、TC、FFA、ALT、AST、FPG、FINS水平，并根据公式计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR=FPG×FINS/22.5)。

1.4.2肝指数 取血后分离小鼠肝脏组织，称重并计算肝指数，肝指数=肝脏重量/体重×100%。

1.4.3肝脏组织病理学观察 取肝组织，制备石蜡切片，按照说明书进行HE染色和油红O染色，在电子显微镜下观察肝脏的脂质聚集情况。肝脏病理组织学改变参照美国国立卫生研究院指南标准[10]评估，其中脂肪变性、肝小叶炎症均评0～3分，气球样变性评0～2分，NAS总分0～8分。同时采用Image J软件计算油红O染色面积。

1.4.4肝组织中AMPK/SREBP-1c信号通路蛋白表达情况 采用Western blot法检测：取各组小鼠适量肝组织，冰上剪成细小碎片，加入RIPA裂解液后于冰上制备组织匀浆，12 000×g离心10 min收集上清，BCA法测定蛋白浓度，取50 μg蛋白上样后聚丙烯酰胺凝胶电泳、转印，加入脱脂牛奶封闭1 h。按照说明书加入适当比例的AMPK、p-AMPK、SREBP-1c和β-actin兔抗鼠单克隆抗体，4 ℃孵育过夜，加入稀释后的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗后孵育1 h。加入超敏ECL显影液显影，室温下放置2 min，凝胶成像系统扫描并分析，以目标蛋白与β-actin条带的比值计算目的蛋白的相对表达量。

1.4.5肝组织中AMPK/SREBP-1c信号通路相关mRNA表达情况 使用RT-qPCR法检测：用TRIzol试剂盒提取肝组织总RNA，在反转录酶的催化下合成cDNA，以cDNA为模板在Taq DNA聚合酶催化下进行PCR扩增。扩增条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，循环40次；72 ℃ 10 min。AMPK引物为5’-TAGACAGAAGATTCGCAGTT-3’和5’-CCAGACACATATTCCATTACC-3’；SREBP-1c引物为5’- GTACAGAAAGTTGCA GGGGAAG-3’和5’- ACATAGCACCAACATGGGATTC-3’；β-actin引物为5’-GG AGATTACTGCCCTGGCTCCTA3’和5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’。PCR产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像仪采集图像，PCR仪获得产物Ct值,采用2-ΔΔCt相对定量计算公式计算分析。

2 结 果

2.1各组小鼠血清生化指标水平比较 模型组小鼠血清TG、TC、FFA、ALT、AST、FPG、FINS水平及HOMA-IR均明显高于空白组(P均<0.05)，二甲双胍组和益气健脾汤组各指标均明显低于模型组(P均<0.05)。见表1。

表1 空白组和非酒精性脂肪性肝病各组小鼠血清生化指标水平比较

2.2各组肝脏组织病理形态 HE染色及油红O染色显示，模型组小鼠肝组织可见肝细胞明显肿胀、气球样变性，大泡样脂滴形成并融合；二甲双胍组和益气健脾汤组肝细胞肿胀、气球样病变、脂肪变性均较模型组轻，尤其是益气健脾汤组油红O染色以小脂滴形式存在。见图1。

图1 空白组和非酒精性脂肪性肝病各组小鼠肝脏组织HE染色及油红O染色表现

2.3各组小鼠肝指数及肝脏组织病理形态NAS评分和油红O染色面积比较 模型组小鼠肝指数、NAS评分和油红O染色面积均明显高于空白组(P均<0.05)，二甲双胍组和益气健脾汤组各指标均明显低于模型组(P均<0.05)，并且益气健脾汤组NAS评分及油红染色面积均明显低于二甲双胍组(P均<0.05)。见表2。

表2 空白组和非酒精性脂肪性肝病各组小鼠肝指数及肝脏组织病理形态NAS评分和油红O染色面积比较

2.4各组小鼠肝组织中AMPK/SREBP-1c蛋白表达情况比较 各组小鼠肝组织中AMPK蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；与空白组比较，模型组小鼠p-AMPK蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)，SREBP-1c蛋白相对表达量明显升高(P<0.05)；与模型组比较，二甲双胍组及益气健脾汤组p-AMPK蛋白相对表达量明显升高(P均<0.05)，SREBP-1c蛋白相对表达量明显降低(P均<0.05)，并且益气健脾汤组SREBP-1c蛋白相对表达量明显低于二甲双胍组(P<0.05)。见图2及表3。

图2 空白组和非酒精性脂肪性肝病各组小鼠肝组织中AMPK、p-AMPK及SREBP-1c蛋白表达情况

表3 空白组和非酒精性脂肪性肝病各组小鼠肝组织中AMPK、p-AMPK及SREBP-1c蛋白相对表达量比较

2.5各组小鼠肝组织中AMPK和SREBP-1c mRNA表达情况比较 各组小鼠肝组织中AMPK mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；模型组小鼠肝组织中SREBP-1c mRNA相对表达量明显高于空白组(P<0.05)，二甲双胍组和益气健脾汤组均明显低于模型组(P均<0.05)，并且益气健脾汤组明显低于二甲双胍组(P<0.05)。见表4。

表4 空白组和非酒精性脂肪性肝病各组小鼠肝组织中AMPK和SREBP-1c mRNA相对表达量比较

3 讨 论

NAFLD的具体发病机制目前尚未明确，“多重打击”学说近些年来已逐渐被大家认可[6]。“多重打击”学说认为胰岛素抵抗、氧化应激、脂肪组织功能障碍、脂肪酸、肠道菌群、线粒体功能障碍、炎症激活、内质网应激、饮食因素、铁超载等代谢功能障碍以及遗传等因素均参与NAFLD的进展。本实验以“多重打击”中占主导地位的糖脂代谢异常为出发点进行了研究，结果显示NAFLD模型小鼠血脂指标、肝功能指标、FPG、FINS、HOMA-IR、肝指数、NAS评分和油红O染色面积均明显高于正常小鼠，证实NAFLD存在明显糖脂代谢异常。

AMPK是一种异源三聚体，由α、β和γ亚基组成，其中α为催化亚基，β、γ为调节亚基。AMPK具有调节能量代谢的作用，其作为高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶广泛存在于真核生物体内[7-8]，在体内的多个脏器中均有表达，能感受到机体细胞内AMP/ATP比值的变化，参与调节细胞的能量代谢过程，是机体的“代谢主控开关”[9-10]。目前关于NAFLD的研究显示， AMPK的活化对脂质代谢具有重要调控作用[11-12]。激活后的AMPK可增强脂肪分解代谢而产生ATP，并同时降低ATP的消耗来维持细胞能量的稳定状态，以此调节脂质代谢相关酶的活性，调控肝内脂肪酸的合成与氧化[13]。AMPK 可通过磷酸化以增强下游线粒体的功能，提高能量代谢率；也可抑制脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)等脂肪合成酶活性，抑制脂肪合成，减少脂质在肝脏中的沉积[14]。

固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)是肝细胞内脂质蓄积的重要调控因子[15]，其由SREBP-1a、SREBP-1c及SREBP-2三种同型异构体组成，其中 SREBP-1c构成了动物体内90%的SREBP-1。SREBP-1c主要在肝脏和脂肪细胞中表达[16],其通过调节脂肪代谢相关酶来调控体内的脂肪合成,并能抑制线粒体转运蛋白,促进三酰甘油正平衡,减少极低密度脂蛋白胆固醇的合成。同时高胰岛素可促进SREBP-1c表达，SREBP-1c表达失调与脂肪肝、血脂异常和2型糖尿病的发生密切相关[17]。AMPK是负向调控SREBP-1c的上游因素之一[18]。AMPK/SREBP-1信号轴在脂肪肝发病机制中被认为是非常重要的分子靶点，AMPK磷酸化可以间接抑制SREBP-1c的表达[19]。由此可见，AMPK/SREBP-1c信号通路是改善肝脏糖脂代谢的关键环节。本实验结果显示，模型组小鼠p-AMPK蛋白相对表达量明显降低，SREBP-1c蛋白和 mRNA相对表达量均明显升高，证实NAFLD模型小鼠存在AMPK/SREBP-1c表达异常。

益气健脾汤方中黄芪、丹参、泽泻、黄连等多味中药有改善糖脂代谢的作用[20-23]。本实验结果显示，益气健脾汤组小鼠血脂指标、肝功能指标、FPG、FINS、HOMA-IR、肝指数、NAS评分和油红O染色面积均明显低于模型组，提示益气健脾汤可以显著改善高脂饮食诱导产生的胰岛素抵抗及高血脂症，改善肝脏组织的脂质蓄积。AMPK/SREBP-1c表达水平检测结果显示，益气健脾汤组p-AMPK蛋白相对表达量均明显高于模型组，SREBP-1c蛋白和 mRNA相对表达量均明显低于模型组。提示益气健脾汤可以上调小鼠肝脏组织中p-AMPK表达，下调SREBP-1c表达，AMPK/SREBP-1c是益气健脾汤治疗NAFLD的靶点之一，但其具体机制尚需进一步深入研究。

综上所述，益气健脾汤对NAFLD小鼠的糖脂代谢具有一定调节作用，其机制可能与调控AMPK/SREBP-1c信号通路有关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。