慢性萎缩性胃炎大鼠胃组织Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达及意义

陈婉珍，刘 翔，严展鹏，王震凯

(1. 南京中医药大学附属南京中医院，江苏 南京 210022；2. 江苏省中医药研究院，江苏 南京 210028)

慢性萎缩性胃炎是消化系统常见的难治性疾病，据最新全球癌症统计数据显示，胃癌在全球癌症死亡率及中国癌症发病率中均高居第三位[1]。胃黏膜癌前状态(萎缩和肠化生)和癌前病变(上皮内瘤变)是在胃癌筛查中常见的胃黏膜病变，其中明确慢性萎缩胃炎发病的分子机制对早期胃癌的防治具有重要意义。研究认为，Wnt/β-catenin信号通路是参与调节细胞分化、增殖等过程的一条重要的保守通路，其在多种疾病的发生过程中均发挥着关键作用[2-3]。本实验拟通过甲基硝基亚硝基胍(MNNG)为主要致病因素的综合造模法建立慢性萎缩性胃炎大鼠模型，观察大鼠胃组织中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达情况，以阐明慢性萎缩性胃炎发病与该信号通路密切相关的分子机制，为进一步探究缓解及逆转慢性萎缩性胃炎的疗效机制奠定基础。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 健康清洁级SD大鼠40只，体重(220±20)g，购自南通大学，动物合格证号：SCXK(苏)2017-0011。大鼠饲养于江苏省中医药研究院SPF级动物实验中心，中央空调下架式分笼饲养，每笼5只。实验开始前适应性饲养1周，环境温度22～26 ℃，湿度50%～60%，实验环境每12 h光暗循环。

1.2主要试剂 甲基硝基亚硝基胍(MNNG)购自日本东京化成工业株式会社；盐酸雷尼替丁购自宜昌人福药业有限责任公司；苏木素和伊红染液购自武汉博士德生物工程有限公司；羊抗兔二抗、抗大鼠Wnt-1、GSK-3β、P-β-catenin、LEFs、Cyclin D1及MMP-7 抗体均购自美国CST公司；含0.03%雷尼替丁颗粒状大鼠饲料由南京安立默科技有限公司代生产[苏A饲生字(2002)503]。

1.3实验仪器 生物组织自动脱水机、石蜡包埋机及生物组织摊烤片机购自湖北定源医用材料有限责任公司；全波长酶标仪购自美国Thermo；CKX31倒置生物显微镜购自日本Olimpus公司；图像分析系统购自德国LEICA公司。

1.4分组及造模方法 将40只清洁级SD大鼠随机分为空白组10只和慢性萎缩性胃炎组30只。空调下架式分笼饲养，空白组大鼠予自由饮用清洁水，进食普通颗粒状SPF级饲料。慢性萎缩性胃炎组大鼠参照文献[4-5]方法进行适当调整进行造模：大鼠自由饮用150 μg/mL MNNG溶液(提前配置1 g/L MNNG母液，避光冷藏保存，每日临用时稀释为150 μg/mL溶液装于包裹避光纸的饮水瓶中)，每日更换1次，造模期间不予其他饮水；进食含0.03%雷尼替丁颗粒状饲料，同时配合饥饱失常(每进食2 d禁食1 d)。每4周处死5只模型组大鼠观察造模情况，干预20周确认建立慢性萎缩性胃炎大鼠模型结束。

1.5观察指标及方法

1.5.1一般情况及体重 实验过程中记录2组大鼠反应灵敏度、动作灵活性、毛色、体型及大便情况，每4周称量1次体重。

1.5.2胃组织病理形态 造模结束后麻醉大鼠，剖开腹腔，充分暴露全胃，于距贲门及幽门0.5～1.0 cm处离断，取出全胃，沿胃大弯侧切开并展平，观察胃黏膜大体形态。剪取胃窦及胃体部约0.5 cm×0.5 cm大小组织2块，用10%福尔马林溶液固定后，使用生物组织自动脱水机脱水、透明，石蜡包埋，石蜡切片机进行切片(厚度为5 μm)。用镊子平铺切片于45 ℃水中，载玻片捞片中段，烤片3 h，将制备的石蜡切片放入37 ℃温箱12 h，进行HE染色，滴加中性树胶，盖玻片封片，光学显微镜下观察大鼠胃组织的病理形态。

1.5.3胃组织中P-β-catenin、LEFs及Cyclin D1蛋白表达及分布情况 造模20周后，采用免疫组织化学法(IHC)检测：取制备好的石蜡切片，放入二甲苯、乙醇及蒸馏水中进行组织脱蜡；将切片放入切片架置于不锈钢罐中，用柠檬酸钠抗原修复液煮沸10 min进行抗原修复；将玻片放于免疫组化盒内后用油性笔(PAP Pen)画圈，PBS冲洗，滴加一抗使之充分浸润，放入4 ℃冰箱过夜；取出免疫组化盒，室温放置30 min，PBS冲洗玻片，洗掉一抗，滴加二抗；滴加DAB显色液，观察显色至棕褐色时，入水停止显色反应；冲洗掉DAB显色液，苏木素60 s复染，分化液作用4～5 s，冲洗后入温水反蓝衬染；乙醇进行脱水，二甲苯进行脱蜡，封片。 在显微镜下，每一组蛋白均手动调节曝光和增益值在同一环境，随机选取5个视野采集照片，采用Image J图像分析软件，选择常用指标参数阳性面积比分析P-β-catenin、LEFs及Cyclin D1蛋白表达及分布情况。

1.5.4胃组织中Wnt-1、GSK-3β及MMP-7蛋白表达情况 造模20周后，采用Western blot法检测：取-80 ℃冰箱冻存胃组织，放入预冷的研钵中加入液氮进行快速研磨，加入Western及IP细胞裂解液，超声细胞破碎仪及离心机处理后取上清，加入loading buffer后煮沸保存。蛋白标准配制液将蛋白标准溶解，在96孔板内滴加标准品及样本，加入BCA工作液，酶标仪测定A562波长的吸光度并计算，进行蛋白浓度测定。配制SDS-PAGE 10%分离胶及5%浓缩胶；电泳：上清煮沸并离心，点样，配电泳液进行电泳，当溴酚蓝跑到胶板底时，停止电泳；转膜：现配1×转膜液，整套转膜装置于转膜液中浸泡处理，去除上层浓缩胶后置于转移槽中进行冰水转膜；5%奶粉中进行封闭；参照marker蛋白红线，去掉两层护卡膜，将膜夹入长盒中，方格中提前放置一抗孵育过夜；加二抗与一抗结合；扫膜，分析。

2 结 果

2.12组大鼠一般情况及体重比较 空白组大鼠反应灵敏，动作灵活，毛色光滑、亮白，体型肥胖，大便呈正常颗粒状，体重增长迅速；慢性萎缩性胃炎组大鼠逐渐出现精神萎靡，喜卧扎堆，活动减少，皮毛稀疏且毛色发黄、光泽度差，大便时呈溏稀或不成形状态，体重增长相对缓慢，16周后体重呈缓慢上升及平稳趋势，且造模12周、16周、20周的体重均明显低于空白组(P均<0.05)。见表1。

表1 2组大鼠不同时间点体重比较

2.22组大鼠胃组织病理表现 空白组大鼠胃黏膜腺体形状规则、排列紧密，上皮层次完整，细胞排列紧密、整齐。造模20周后，慢性萎缩性胃炎组大鼠胃黏膜变薄、缺失，腺体明显减少、结构紊乱，胃小凹延长、扭曲，可见杯状细胞、潘氏细胞或异性细胞；黏膜肌层增厚，甚或向胃黏膜固有层呈树枝样延伸。见图1及图2。

图1 空白组大鼠胃组织病理形态(HE染色，×100)

图2 慢性萎缩性胃炎组大鼠胃组织病理形态(HE染色，×200)

2.32组大鼠胃组织中P-β-catenin、LEFs、Cyclin D1蛋白分布及表达情况 P-β-catenin阳性信号主要位于细胞质，空白组呈颗粒状深紫色，模型组呈紫色，模型组P-β-catenin阳性面积比明显低于空白组(P<0.05)。LEFs阳性信号主要位于细胞核内，空白组呈紫棕色颗粒状，模型组呈深紫褐色，模型组LLEFs阳性面积比明显高于空白组(P<0.05)。Cyclin D1阳性信号主要位于细胞核内，空白组呈棕褐色，模型组呈深棕褐色，模型组Cyclin D1阳性面积比明显高于空白组(P<0.05)。见图3及表2。

图3 2组大鼠胃组织中P-β-catenin、LEFs、Cyclin D1蛋白表达及分布情况(免疫组化染色，×200)

表2 2组大鼠胃组织中P-β-catenin、LEFs、Cyclin D1阳性面积比

2.42组大鼠胃组织中Wnt-1、GSK-3β及MMP-7蛋白表达情况 慢性萎缩性胃炎组大鼠胃组织中Wnt-1和MMP-7蛋白相对表达量明显高于空白组(P<0.05)，GSK-3β蛋白相对表达量明显低于空白组(P<0.05)。见图4。

图4 2组大鼠胃组织中Wnt-1、GSK-3β及MMP-7蛋白表达情况

3 讨 论

慢性萎缩性胃炎是临床常见的慢性胃部疾病，其发生机制尚不明确，现代医学对该病以对症治疗及定期内镜随访为主，缺乏更优效的治疗方案[6]。中医药在慢性萎缩性胃炎的治疗方面具有一定优势，通过中医思路的诊疗，可有效改善患者临床症状，且可逆转轻、中度萎缩及局灶性肠化生等病理改变[7]；对于重度萎缩及低级别上皮内瘤变者，可达到减轻病变程度及延缓病情进展的效果[8]。

目前研究显示，Wnt/β-catenin信号通路在胃癌发生、胃黏膜损伤修复等过程中均发挥关键作用[9-10]。一般情况下，Wnt信号处于未激活状态，细胞质内形成Axin/GSK-3/APC复合物，CK1及GSK-3等对β-catenin残基进行磷酸化后由泛素-蛋白酶体系统降解。而在一定条件下，Wnt蛋白家族与细胞膜上的Frizzled、LRP 5/6受体结合，导致细胞质Dvl蛋白激活并磷酸化，抑制GSK-3蛋白活性，从而干扰胞质内Axin/GSK-3/APC/β-catenin复合物形成，导致β-catenin不能磷酸化而降解，故β-catenin在细胞质内富集后进入细胞核，与LEF/TCF结合后激活下游的转录过程，从而调节细胞的分化、增殖等过程[11-12]。Wnt-1蛋白是该信号通路上游重要的蛋白，张晓峰等[13]研究显示，在胃癌组织中Wnt-1蛋白异常高表达，且与胃癌组织的癌灶大小、分化程度以及浸润深度等均有一定关系，认为其可作为评价胃癌病情及预后的参考指标之一。Wang等[14]报道，Wnt拮抗基因APC、SFRP1、WIF-1、DKK-1等的高甲基化状态与胃癌有一定关系，且可能与慢性萎缩性胃炎的发生相关。

本实验结果显示，以MNNG为主要致病因素的综合造模法可成功建立慢性萎缩性胃炎大鼠模型；慢性萎缩性胃炎大鼠胃组织中P-β-catenin蛋白阳性信号主要位于细胞质，通路下游LEFs及Cyclin D1蛋白阳性信号主要位于细胞核内，且胃组织中β-catenin蛋白阳性面积比和GSK-3β蛋白相对表达量均明显降低，LEFs及Cyclin D1蛋白阳性面积比和Wnt-1、MMP-7蛋白相对表达量均明显增加。说明慢性萎缩性胃炎大鼠的发病与Wnt/β-catenin信号通路密切相关，为慢性萎缩性胃炎的疗效机制研究提供了一定思路和科学基础。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。