MALDI-TOF-MS联合分离胶法检测血培养阳性标本对 病原菌的鉴定作用

李峻雅，孙增辉，韩亮，邱淑妍

(惠州市第三人民医院，广东 惠州 516000)

0 引言

当前临床随着抗生药物滥用与创伤性诊疗技术的广泛开展，多种感染性疾病发病率逐年上升，明确病原菌，是选择合适抗菌药物治疗感染性疾病的关键[1]。血培养为病原菌检查的金标准，具有较高的诊断价值，但耗时较长，从阳性警示到最终的药敏实验结果至少需要48h，这对于感染病情较重的患者而言，临床应用价值较低[2]。因此，寻求方便快捷且准确度高的新型病原菌鉴定技术为感染性疾病患者的治疗研究重点[3]。MALDI-TOF-MS为近年来的新兴软电离生物质谱，其基本工作原理为利用激光为能量来源，将待测细菌表面成分解析为离子，经过飞行时间检测器的时间长短将不同质荷比(m/z)的离子分离，以此形成不同高度的波谱峰质谱图[4]。再利用标准的菌株分型系统，可有效向其进行细菌种属鉴定，具有较高的准确率、特异性和灵敏度，因此在临床中已得到广泛应用[6]。若在其基础上联合分离胶法检测，通过利用分离胶法的血清稳定优势，可加快分离血液中红细胞和血清，降低误差，可进一步缩短细菌鉴定时间，提高准确率并且降低医疗成本。但当前临床对于两者联合应用的准确度研究较少，基于此，本文就对MALDI-TOF-MS联合分离胶法检测血培养阳性标本对病原菌的鉴定作用展开研究，具体如下。

1 对象和方法

1.1 对象

以我院2020年10月至2021年2月内收治的211例感染性疾病患者的阳性血清样本为本次研究标本，所选研究对象中男女分别占比54.50%(115/211)、45.50%(96/211)；年龄段为18～90岁，平均67.43±5.11岁；经血培养检出，革兰阳性菌共91例、革兰阴性菌87例、真菌33例。

1.2 方法

所选血清标本均行MALDI-TOF-MS联合分离胶法检测，具体检测方法为：血清标本均转移至INSEPACK@ST740CG型真空采血管中，混匀后实施常规离心处理，去上层清液，以经高压处理后的无菌棉签挑取分离胶表面菌体富集物，加入75%1mL乙醇溶液重悬，混匀后以20817×g离心2min，取沉淀物，点样沉淀1μL至96孔金属靶板，室温干燥后，96孔金属靶板点样甲酸水溶液1μL以裂解细菌菌体，待干燥后点样乙腈μL用以萃取菌体蛋白，进样至MALDI-TOF-MS系统中进行细菌菌种分析。实验过程按《全国临床检验操作规程》严格执行。实验过程按《全国临床检验操作规程》严格执行。

细菌分离及传统鉴定：细菌的分离提纯标本分别接种于血琼脂、麦康凯平板培养基中，置于含有5%CO2的35℃孵箱中孵育24 h后，挑取培养基上生长的菌落制备成细菌悬液上机鉴定。细菌鉴定使用梅里埃提供的VITEK-2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪及配套鉴定和药敏卡。所有菌株的分离培养严格按照《全国临床检验操作规程》进行。

1.3 观察指标

所选血清样本进行MALDI-TOF-MS联合分离胶法检测，检测结果与传统的梅里埃VITEK-2 Compact全自动细菌分析仪鉴定结果进行对比，若有不符，以16SrRNA序列分析结果作为金标准。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行处理，百分比(%)表示计数资料。

2 结果

2.1 革兰阳性菌快速鉴定法符合率分析

MALDI-TOF-MS联合分离胶法检测的革兰阳性菌符合率为78.02%(71/91)，详情见表1。

表1 革兰阳性菌快速鉴定法符合率分析 [n(%)]

2.2 革兰阴性菌快速鉴定法符合率分析

MALDI-TOF-MS联合分离胶法检测的革兰阴性菌符合率为85.06%(74/87)，详情见表2。

表2 革兰阴性菌快速鉴定法符合率分析[n(%)]

2.3 真菌快速鉴定法符合率分析

MALDI-TOF-MS联合分离胶法检测的真菌符合率为24.24%(8/33)，详情见表3。

表3 真菌符合率分析[n(%)]

3 讨论

感染性疾病种类很多，一般由病原微生物引起的机体疾病统称为感染性疾病，细菌、真菌、病毒、原虫、蠕虫、支原体、衣原体等均病原微生物侵袭机体后，均可归为感染性疾病，其中细菌及真菌最为常见。当前，随着我国正式迈入老龄化社会，老年人群基数的增加，导致以老年人为高发群体的多种疾病发病率居高不下，而老年人受身体机能退化影响，对上述致病菌的抵抗力较弱，在受原发性疾病因素影响下，感染风险也随之上升。而明确致病菌种属，是正确使用抗菌药物的关键[6]。

MALDI-TOF-MS是有基质辅助激光解析离子源(MALDI)与飞行时间质量检测器(TOF)两部分组成，其中MALDI是利用一定强度的激光照射血清标本与基质形成共结晶薄膜，当基质从激光吸取能量后，可逐渐汽化降解，使标本分解吸附，产生电离反应[7]。在此基础上，TOF通过记录带有电荷的标本分子在电场作用下的飞行时间以此形成质量图谱，再结合标准化的细菌种属图谱系统明确受检细菌种属，以此实现致病菌的区分与鉴定[8]。但单一使用是对于血清的标本取样耗时较长，因此，此技术在临床应用时，多联合分离胶法共同检测。其促凝优势，可快速分离血清与沉淀物，缩短检测时长，取得明确诊断价值[9]。且此方式的成本较低，实用性强，患者接受度较高，安全性能也较高，无过多转移、洗涤工序，对标本的污染风险较低[10]。而本研究结果也显示，通过将两者联合用于感染性疾病患者的病原菌鉴别中，对于革兰阴性菌符合率最高，阳性率次之，真菌符合率最低。提示，MALDI-TOF-MS对于革兰阴性菌的检出率更高，分析原因，可能与革兰阴性菌细胞壁的肽聚糖较薄且没有磷壁酸，但具有外膜等特点有关，这正好符合MALDI-TOF-MS的结晶薄膜作用机制，可有效提高其激光能量吸附作用，促使其快速产生电离反应和形成质量图谱，进而起到细菌种属鉴别作用[11-12]。由此可见，MALDI-TOF-MS联合分离胶法检测对于革兰阴性菌的鉴别应用价值更高，可此进行深入研究。

综上所述，以MALDI-TOF-MS联合分离胶法检测血培养阳性标本，可取得较高的病原菌检出准确率，其方便快捷，可为患者的早期治疗提供可靠参考。