小鼠羊水间充质干细胞的分离、培养及鉴定

吴航飞 王康淳 潘崎 程颖

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有再生、多向分化以及免疫调节能力，可作为药用细胞移植到人体，缓解炎症反应，促进局部组织恢复，改善移植位点血运，并调节受者免疫环境，因而受到人们的关注[1]。MSC广泛分布于人体多种组织内，其中新生儿相关组织，如脐带、羊水、羊膜、胎盘组织等还可无创获取，伦理学争议较小，且细胞本身的突变风险较低，相对于成人来源细胞各方面能力更突出，是细胞治疗来源的最佳选择[2]。已有实验证明，人羊水中含有MSC[3]。但将人体细胞应用于实验动物，可导致强烈的免疫排斥反应，且羊水获取较为不便，因此，若是能从实验动物体内提取羊水MSC（amniotic fluid-derived MSC，AF-MSC），将更有利于基础实验研究。

C57BL/6小鼠是目前主流的实验动物之一，本实验从C57BL/6怀孕母鼠体内分离出子宫，首次成功提取小鼠AF-MSC，并对其进行细胞鉴定，为细胞移植相关治疗方案提供新的细胞来源及研究思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级C57BL/6小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，进行常规喂养，使其自然交配，在母鼠怀孕约12 d时抽取羊水。小鼠AF-MSC的分离、培养、鉴定均在中国医科大学附属第一医院器官移植实验室完成，并得到中国医科大学伦理委员会批准。

细胞培养基、胎牛血清、胰酶均购于美国Gibco公司，CCK-8试剂盒购于美国APExBIO公司，台盼蓝染色液购于北京索莱宝科技有限公司，三系分化诱导试剂盒购于赛业（苏州）生物科技有限公司。干细胞抗原（stem cell antigen，Sca）-1、CD29、CD44、CD34、CD45流式抗体均购自美国Thermo Fisher公司。

1.2 AF-MSC分离与培养

脱颈处死孕鼠，75%酒精浸泡消毒，剖开腹部，分离子宫，将其置于磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）中清洗，尽可能去掉血渍。使用镊子提起并固定子宫壁一段，另一只镊子沿子宫长轴将胎鼠向下压，将羊水挤压至上极，形成一个小水泡，此时使用1 mL注射器将羊水抽出。获取羊水后，采用70 μm孔径的细胞筛网对其进行过滤，收集滤液，300×g离心5 min，去除上清，PBS清洗后再次离心，去除上清，将细胞沉淀置于培养皿（直径3 cm）中，加入培养基，置于细胞培养箱（37 ℃，5% CO2）中培养72 h。

培养4 d后镜下观察，根据细胞密度决定是否进行换液。7 d时镜下观察，若细胞融合度达到80%～90%，则进行1∶2或1∶3传代；若细胞密度过低，则再次进行换液，待其融合度提升后传代。传代时，PBS清洗2次，尽可能去除残留的培养基，用胰酶消化1 min，加入含10%胎牛血清的培养基中止消化，反复吹打，将所获得的单细胞悬浮液300×g离心5 min。去除上清液，用完全培养基将细胞重悬，转移到新的培养皿中培养。

1.3 实验方法

1.3.1 AF-MSC生长曲线的绘制 取生长状态良好的第3、5、7代细胞（P3、P5、P7）进行消化，制成2×104/mL的细胞悬液。将细胞接种于96孔板，于细胞培养箱中培养，分别于培养的1、2、3、4、5、6、7 d测量吸光度（absorbance，A）。事先加入CCK-8试剂，每孔10 μL，然后置于培养箱中孵育1 h，酶标仪测定450 nm波长A值（型号PowerWave XS2，美国BioTek公司）。

1.3.2 AF-MSC表面标志物的鉴定 流式细胞术鉴定AF-MSC表面标志物，取生长状态良好的P1、P3、P5细胞，消化后用PBS重悬，制成1×108/mL单细胞悬液，加入 Sca-1、CD29、CD44、CD34、CD45抗体孵育30 min。PBS清洗后收集细胞沉淀，再用PBS重悬，取流式管，每管加入100 μL细胞悬液，加入PBS调整细胞浓度，上机检测（型号FACSCanto Ⅱ，美国BD公司）。

1.3.3 AF-MSC三系分化能力的检测 取P4 AF-MSC进行三系分化培养，诱导分化培养液根据说明书进行配置。将细胞以2×104/cm2的密度接种于6孔板，每孔加入普通完全培养基2 mL，置于培养箱中培养。当细胞融合度达到70%时，弃去原有的培养基，PBS清洗1～2次，随后加入诱导分化培养液（成骨诱导分化培养液、成脂诱导分化培养液），每隔3 d换液，成骨诱导25 d，成脂诱导21 d，随后用茜素红进行成骨染色，用油红O进行成脂细胞染色，然后置于显微镜下观察（型号TS100，日本Nikon公司）。

将4×105个细胞转移至15 mL离心管中，20 ℃，250×g离心4 min，去上清，加入0.5 mL成软骨诱导分化培养液重悬，20 ℃，150×g离心5 min，去上清，清洗细胞，随后再加入0.5 mL成软骨诱导分化培养液，150×g离心5 min，拧松离心管管盖以便于气体交换，将其竖立放置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中，24 h后观察到细胞出现聚团现象，轻弹离心管底部，使得软骨球脱离管底而悬浮于培养基中，每隔3 d更换1次培养基，诱导21 d后进行切片和阿利新蓝染色，置于显微镜下观察（型号ECLIPSE 80i，日本Nikon公司）。

1.3.4 冻存AF-MSC的活力检测 细胞消化后100×g离心5 min，去上清，收集沉淀，加入1 mL无血清细胞冻存液，然后将细胞混匀，制成细胞混合液，转入冻存管中，及时置于−80 ℃环境冻存。

取出冻存管，立即放入37 ℃水浴锅中快速解冻。待冻存管中细胞混合液完全融化后，立即加入1 mL细胞培养液进行混合，然后将其加入5 mL细胞培养基中，300×g离心5 min，去上清，加入完全培养基，将细胞沉淀与培养基混匀，取0.1 mL细胞悬液与0.4%台盼蓝染色液0.9 mL混匀，3 min内用细胞计数板计数活细胞与死细胞，其中死细胞被染成蓝色，而活细胞呈无色透明状。细胞存活率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）。

1.4 研究内容

观察P0、P2、P4 AF-MSC的形态。分析P3、P5、P7 AF-MSC的增殖特点。鉴定P1、P3、P5 AF-MSC表面标志物Sca-1、CD29、CD44、CD34、CD45的表达。检测P4 AF-MSC的三系分化能力。检测P3 AF-MSC冷冻复苏后的细胞活力和增殖能力。

1.5 统计学方法

采用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示；采用Two-way ANOVA Turkey多重比较分析P3、P5、P7的AF-MSC增殖能力的差异；采用Two-way ANOVA Sidak多重比较分析冻存前后细胞增殖能力的差异。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 AF-MSC的形态学观察

原代培养的AF-MSC形态学观察结果见图1，P0 AF-MSC基本上为梭形细胞，以局部细胞岛的形式呈现，其中含有较多的漂浮杂质细胞或死亡的细胞，还有少量的组织块（图1A、B）。P2 AF-MSC（图1C、D）与P4 AF-MSC（图1E、F）镜下呈现较为典型的梭形、漩涡状的细胞群（融合度＞80%），大小相近，形态趋于一致，存在少许偏圆的杂质细胞，这可能是羊水中存在的异质性细胞，也可能是在培养的过程中，细胞形态发生了改变。

图1 AF-MSC的形态Figure 1 The morphology of AF-MSC

2.2 AF-MSC的增殖特点

小鼠AF-MSC的增殖曲线见图2。AF-MSC传代培养均无明显潜伏期，培养2～3 d进入对数增长期，增长速度最快，之后增殖速度减慢，进入平台期。P7 AF-MSC在7 d时的增殖能力优于P3，差异有统计学意义（P＜0.05/3），其余时间段 P3、P5、P7 AF-MSC的增殖能力差异均无统计学意义（均为P＞0.05）。

图2 AF-MSC的增殖曲线Figure 2 Proliferation curves of AF-MSC

2.3 AF-MSC表面标志物检测

P1、P3、P5 AF-MSC表面标志物检测结果见图3。AF-MSC表达 Sca-1、CD29、CD44（阳性率＞90%），不表达CD34、CD45（阳性率＜5%）。且随着传代次数的增加，CD29、Sca-1、CD44的阳性率逐渐上升，提示AF-MSC可以通过传代而得以纯化。

2.4 AF-MSC的三系分化

AF-MSC成骨分化后，矿化结晶被茜素红染成深红色的点状（图4A）；成软骨分化后，分泌的酸性粘多糖被阿利新蓝染成淡蓝色（图4B）；成脂分化后，胞质脂滴被油红O染成红色（图4C）。

图3 AF-MSC表面标志物的流式细胞图Figure 3 Flow cytometry of surface markers of AF-MSC

图4 AF-MSC的三系分化染色图Figure 4 The trilineage differentiation figures of AF-MSC

2.5 冻存AF-MSC复苏后的活力

冻存AF-MSC复苏后存活率＞96%，生长状态良好。与冻存前比较，冻存AF-MSC复苏培养6 d时增殖能力升高，差异有统计学意义（0.779±0.013比0.818±0.027，P=0.027），其余时间冻存后AF-MSC的增殖能力差异均无统计学意义（均为P＞0.05）。

3 讨 论

MSC最先由Friedenstein等[4]于1974年从骨髓中提取，后来在脂肪、皮肤、肌肉、牙髓、毛囊、胎儿附属物等各种不同组织中也提取出了MSC[5-7]。随着研究的深入，人们发现骨髓MSC随体外扩增次数的增加，增殖与分化能力明显下降，凋亡增加[8]，而且获取方法均为有创，伦理争议较大，不利于其应用推广[9]。上述问题在成体干细胞中也都存在。因此，寻找一种能用作细胞治疗最优的MSC成为了新的研究目标。

早在2003年，就有研究者在孕中期羊水中发现了类似MSC的细胞[10-12]，并认为此时期羊水中的细胞较为丰富，也因此引起了人们的关注。2007年，De Coppi等[13]在人源羊水中提取出MSC，并发现该细胞增殖代数可达250代，且增殖速度无明显改变，仍能够保持较长的端粒酶长度，总体特征与MSC类似，部分特性与胚胎干细胞类似，但不会形成畸胎瘤，首次将其定义为AF-MSC。AF-MSC介于成体干细胞与胚胎干细胞之间，可无创获取，伦理争议较小。与骨髓MSC相比，AF-MSC在体外增殖培养的过程中更不易衰老，自我DNA修复的能力更强[14]，且拥有更强的旁分泌能力，移植后的修复能力也更强[15]。

人体羊水的收集较为困难，不利于进行深入研究。且人源细胞因实验伦理、作用机制未明确等原因不能直接应用于人体进行体内试验，而将其应用于实验动物，可能会导致迅速发生排斥反应，选择免疫缺陷动物则无法较好呈现其免疫调节能力。小鼠是目前实验室最常用的动物，是用于基础实验研究的理想模型，因此我们尝试从小鼠提取AF-MSC。羊水中的细胞来源多样，来源于各个胚层，其中的主要成分是来源于胎儿皮肤脱落的细胞，除此之外还有来自泌尿系统、呼吸系统、消化系统、脐带、胎膜等成分的细胞[16]，根据细胞形态可将羊水细胞分为羊膜细胞（60.8%）、上皮样细胞（33.7%）和成纤维细胞（5.5%）[17]。这就意味着羊水来源的产品可能具有一定的异质性，导致其应用的不确定性和复杂性增加。本研究结果发现AF-MSC可以随着传代次数的增加得以纯化，不同孕期的羊水成分不同，细胞产品的活性也不同，什么时期的AF-MSC产量最高、性能最好？都有待研究人员更深入的探索。尽管还存在着不确定性，但AF-MSC的应用价值已经得到了初步肯定。有研究证明，AF-MSC能够对肺不同部位细胞的损伤做出应答，促进其修复[18]。Park等[19]实验证明，AF-MSC可通过Nanog基因的表达，增强自身的增殖能力，同时增强旁分泌作用，加速真皮乳头细胞活性，促进毛囊再生。Takov等[20]发现在缺血心脏模型中，AF-MSC可通过分泌作用保护心脏，促进血管生成。AF-MSC还具有修复能力和抗衰老能力[21-23]，广泛应用于神经、骨再生等领域[24-25]，具有较好的应用前景[26]。

为了满足基础实验研究，推进临床转化，本实验从小鼠体内成功提取AF-MSC，其形态与MSC典型形态大致相符[27]，具有较强的增殖能力，且不会随着传代的增加（P0～P7）而衰减。细胞表面标志物鉴定结果显示，Sca-1、CD29、CD44表达阳性，CD34、CD45表达阴性，证明本实验分离的细胞为AF-MSC。

综上所述，MSC因其多向分化能力、免疫调节能力、低免疫原性而被人们所关注[28]，筛选出性能最佳的细胞，研究其作用机制，将为许多疾病提供新的治疗思路和方法。本研究结果证实小鼠AF-MSC提取的过程较为简便，提取成本较低，细胞冻存复苏后存活率高，增殖能力未受影响，可长期保存以备实验之需，适合于基础实验研究。

致谢：感谢器官移植实验室李弘、于家楠、赵宁、许铁，普外实验室李越、张晓姣对该实验给予的帮助。