UPLC-Q/TOF-MS 法测定虎杖中虎杖苷、白藜芦醇、大黄素在高脂血症鼠体内的药代动力学*

王 敏，王 晶，杨 娜，柳 航，朱怀军**

1 南京大学医学院附属鼓楼医院 药学部，南京 210008；2 南京临床药学中心，南京 210008；3 陕西中医药大学 药学院，咸阳 712046

高脂血症是人体脂肪代谢或转运异常，造成血浆中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）水平高于和/或高密度脂蛋白水平低于正常水平的一种全身性代谢疾病。多项研究[1，2]显示，高脂血症是多种心脑血管疾病的病理基础和主要独立危险因素。故近年来高脂血症的防治逐渐受到医学界的重视和关注，成为心血管领域的研究热点之一。

虎杖系蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum-Sieb.et Zucc.的根和根茎[3]，有清热解毒、散瘀止痛、利湿化痰之功效，该药调脂药效与辛伐他汀相似，且无明显毒副作用[4]。已有研究报告，虎杖中指标性成分虎杖苷[5]、白藜芦醇[6]、大黄素[7]具有调节脂质代谢的作用。同时，越来越多的研究显示，机体生理病理状态对体内成分的药代动力学行为具有一定的影响。因此，开展中药多指标性成分在病理状态下的药代动力学[8]研究，对于揭示中药物质基础、阐明作用机制以及深入开发具有重要的意义。

目前，关于虎杖的药代动力学研究集中在虎杖苷、白藜芦醇和大黄素的单一或某两个成分[9-12]，而3 个成分的同时定量分析未见报道。此外，现有研究多关注虎杖指标性成分在正常动物体内的代谢动力学特征，关于其在高脂血症模型鼠体内的药代动力学研究鲜有报道。

基于此，现借助超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法（u1tra-performance 1iquid chromatography-quadrupo1e/time-of-f1ight mass spectrometry，UPLC-Q/TOF-MS）的高分辨多反应监测扫描模式（high -reso1ution mu1tip1e reaction monitoring，MRMHR），建立血浆中虎杖指标性成分虎杖苷、白藜芦醇、大黄素同时定量分析方法，并应用该方法开展虎杖提取物在高脂血症模型鼠体内的药代动力学研究，探究虎杖指标性成分的药动学特征，为虎杖物质基础的体内过程分析提供参考，为虎杖药用资源的深入开发提供理论依据。

1 仪器与药品试剂

1.1 仪器

Shimadzu ExionLC AD 型超快速高效液相色谱仪；AB SCIEX TripleTOF 5600+型高分辨质谱仪；Eppendorf 5417R 型高速冷冻离心机；Scientific Industries VORTEX-GENIE2 型旋涡混合器；Thermo FisherSpeedVac 离心浓缩仪。

1.2 药品与试剂

对照品：虎杖苷（批号CHB190103）、白藜芦醇（批号CHB180228）、大黄素（批号CHB181208）均购自成都克洛玛生物科技有限公司；内标双氯芬酸钠（批号100334-201803）购自中国食品药品检定研究院。虎杖药材购自甘肃康宁医药科技有限责任公司（批号：1903010），经副主任中药师柳航鉴定为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的根和根茎。乙腈为色谱级、甲酸为分析纯、水为超纯水。

1.3 实验动物

叙利亚金黄地鼠，雄性若干只，体重110～130 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司（SCXK（京）2016-0011）提供。

2 方 法

2.1 色谱条件

采用0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）二元梯度洗脱系统，经waters ACQUITY UPLC BEH C18（1.7μm，2.1mm×100mm）色谱柱分离；流速为0.2mL·min-1；柱温为40 ℃；进样体积5 μL。

梯度洗脱为：0.0～3.0 min，90%～20%A，每次进样前以流动相初始条件90%A 预平衡2 min。

2.2 质谱条件

采用电喷雾离子源（ESI）进行离子化，在负离子模式下进行MRMHR 检测，雾化气和辅助加热气均为345 kPa，气帘气为207 kPa，喷雾电压为-4500 V，离子源温度为550 ℃。

虎杖苷、白藜芦醇、大黄素和内标的高分辨率多反应监测参数见表1。

表1 虎杖苷、白藜芦醇、大黄素和内标的MRMHR 检测参数

2.3 实验方案

参考课题组前期方案[13]构建高脂血症动物模型，金黄地鼠给予普通饲料喂养1 周以适应环境。1周后根据体重随机分为两组：正常组和高脂组。正常组保持正常饮食；高脂组给予高脂饲料（10%w/w 椰子油、0.5%胆固醇），2 周后禁食12 h，分别从眼底静脉丛取血约1 mL，置于肝素化的塑料离心管中，5000 r·min-1离心分取血浆，测定血脂胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），以确证造模是否成功。造模成功后，6 只高脂模型大鼠，以2.0 g·kg-1（以药材计）给予虎杖灌胃液，给药前禁食12 h。分别于给药前及给药后0.083、0.167、0.25、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、3、5、8、12、24 h 经眼底静脉丛取血0.1 mL，置肝素钠浸润的离心管中，4000 r·min-1离心10 min，分离血浆，置-80 ℃冰箱保存备用。

2.4 样品前处理

精密吸取血浆40 μL，依次加入2 μg·mL-1内标标准溶液2 μL 和乙酸乙酯1.0 mL，涡旋混匀5 min，4000 r·min-1离心10 min，取上清液900 μL，于37 ℃真空浓缩，挥干溶剂。固体物以40 μL 乙腈-0.1%甲酸水溶液（80∶20，v/v）涡旋30 s 溶解，14000 r·min-1离心10 min 后，取上清液供仪器分析。

2.5 药材及对照品制备

称取虎杖饮片25 g，加水500 mL，浸渍1 h，加热至沸，保持微沸2 h，趁热用纱布过滤，滤液经冷冻干燥得固体物4.5 g。在虎杖冻干粉中，虎杖苷、白藜芦醇和大黄素的含量分别为3.57%、1.01%和0.62%（以原药材计）。

按《中国药典》2020 年版规定，成人最大日剂量为15 g，根据实验动物与人（成人以60 kg 体重计）按体表面积比折算等效剂量的换算关系，得出金黄地鼠的等效剂量为2.0g（虎杖药材）/kg（体重）。采用0.5%羟甲基纤维素钠溶液悬浮虎杖冻干粉，配制灌胃液，含虎杖冻干粉36mg·mL-1，即虎杖药材0.2g·mL-1。

分别精密称取虎杖苷、白藜芦醇、大黄素对照品和内标适量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解，定容配制成1.0 mg·mL-1对照品贮备液；使用时再精确稀释至所需浓度的对照品溶液。

3 结果

3.1 方法学验证

根据NMPA 和FDA 有关生物样品分析方法验证的相关指导原则，对所建立的高脂血症模型鼠血中虎杖苷、白藜芦醇、大黄素3 个成分以UPLC-Q/TOF-MS法进行检测，从专属性、线性、精密度、回收率及稳定性等方面进行方法学验证。LLOQ、低、中、高浓度水平质控样本中虎杖苷的浓度分别为1、2、80、800ng·mL-1，白藜芦醇和大黄素浓度为0.5、1、40、400ng·mL-1。

3.1.1 专属性考察 将6 份来自不同个体的高脂血症模型鼠的空白血浆、空白血浆加入虎杖苷、白藜芦醇、大黄素和内标，以及高脂血症模型鼠灌服虎杖后的血浆样品，按照“2.4”血浆样品处理方法处理后，分别进行UPLC-Q/TOF-MS 分析，所得典型色谱图见图1。由图1 可见，虎杖苷、白藜芦醇、大黄素和内标的保留时间分别为1.16、1.43、2.47 和2.29 min，且在各成分保留时间处未见干扰，提示血浆中其他成分不影响虎杖苷、白藜芦醇、大黄素和内标的专属性和特异性检测。

图1 高脂血症模型鼠血浆中虎杖指标性成分和内标的典型色谱图

3.1.2 标准曲线 分别精密吸取混合对照品溶液适量，真空挥干后加入空白高脂血浆40 μL，涡旋混匀，配制成含虎杖苷浓度为1、4、10、20、100、200、500、1000 ng·mL-1，以及白藜芦醇和大黄素浓度为0.5、1、2、5、10、50、100、250、500 ng·mL-1的血浆样品，按“2.4”血浆样品处理方法处理，并进行UPLCQ/TOF-MS 分析，记录各成分色谱峰峰面积（As）与相应内标色谱峰峰面积（Ar）。重复多次，以色谱峰峰面积比值R（R=As/Ar）对浓度（C，ng·mL-1）进行线性回归，得各成分的回归方程，见表2。

表2 指标性成分标准曲线

结果表明，虎杖苷血药浓度在1～1000 ng·mL-1、白藜芦醇和大黄素的血药浓度在0.5～500 ng·mL-1范围内，线性关系均良好，r 值均在0.9978 以上。

3.1.3 精密度和准确度 按标准曲线测定方法配制同时含虎杖苷、白藜芦醇和大黄素LLOQ 及低、中、高3 种浓度的血浆样本，按“2.4”血浆样品处理方法处理。在一个分析批内测定5 次，计算批内精密度；连续3 天配制并测定3 个分析批，计算批间精密度，结果见表3。

表3 高脂血症模型鼠血浆中虎杖指标性成分的精密度和准确度

3 个待测成分的批内和批间精密度RSD（%）均＜15%，准确度在-6.9%～7.8%，提示该方法精密度和准确度均良好。

3.1.4 提取回收率和基质效应 按标准曲线测定方法配制含虎杖苷、白藜芦醇和大黄素低、中、高3种浓度的血浆样本各6 份，按“2.4”方法处理血浆样本，记录各待测成分峰面积A1和内标峰面积AIS1，并计算峰面积比值R1（R1=A1/AIS1）。另取空白血浆40 μL，经乙酸乙酯萃取离心后，在获得的上清液中加入相应低、中、高3 种浓度的混合对照品溶液和内标，于37 ℃真空浓缩，挥干溶剂。固体物以40 μL乙腈-0.1%甲酸水溶液（80∶20，v/v）涡旋30 s 溶解，14000 r·min-1离心10 min，取上清液供仪器分析，进样记录各待测成分峰面积A2和内标峰面积AIS2，并计算峰面积比值R2（R2=A2/AIS2）。另取上述低、中、高3 种浓度的混合对照品溶液和内标，于37 ℃真空浓缩，挥干溶剂。固体物以40μL 乙腈-0.1%甲酸水溶液（80∶20，v/v）涡旋30s 溶解，14000r·min-1离心10min后，取上清液供仪器分析，进样记录各待测成分峰面积A3和内标峰面积AIS3，并计算峰面积比值R3（R3=A3/AIS3）。

提取回收率=R1/R2（mean）

内标归一化基质因子=R2/R3（mean）

结果见表4，各待测成分低、中、高3 种浓度的平均回收率均＞80%且稳定，内标归一化基质因子在90.1%～105.8%，RSD＜15%，符合生物样本检定的要求。

表4 高脂血症模型鼠血浆中虎杖指标性成分和内标的提取回收率和基质效应（n=6）

3.1.5 稳定性试验 取含虎杖苷、白藜芦醇和大黄素的低、中、高3 种浓度的质控样本，分别在室温下放置12 h、-80 ℃冰箱保存1 个月和反复冻融3 个循环，考察其稳定性。低、中、高3 种浓度质控样本按“2.4”项下方法处理后，放置于进样器中24 h，考察样本进样器放置稳定性。结果见表5。低、中、高3 种浓度的质控样本的精密度（RSD）和准确度（RE）均在±15%内，表明在考察的存储条件下样本均稳定。

表5 高脂血症模型鼠血浆中虎杖指标性成分的稳定性

3.2 药代动力学结果

高脂血症模型鼠灌服虎杖提取物后，应用所建立的UPLC-Q/TOF-MS 法测定模型鼠体内虎杖苷、白藜芦醇、大黄素的血药浓度，平均血药浓度-时间曲线见图2。

图2 高脂血症模型鼠血浆中虎杖指标性成分的血药浓度-时间曲线（n=6）

采用DAS 2.0 处理软件（中国药理学会）的非房室模型（统计矩法）估算药代动力学参数，包括AUC0～24h、AUC0-∞、MRT0-∞、t1/2，血药浓度的达峰时间（Tmax）和最大血药浓度（Cmax）为实测值，结果见表6。

表6 虎杖指标性成分在高脂血症模型鼠体内主要药代动力学参数（n=6）

4 讨论

中药药代动力学是借用化学药物代谢动力学研究手段，研究中药活性成分、组分、单味中药和复方在机体内的过程及其动态变化规律，以探讨中药的药效物质基础、中药组分的相互作用、中药配伍机制和中药炮制机理等科学问题[14]。由于灵敏度高和专属性强，液相色谱质谱联用法广泛用于中药多成分的定量分析和药代动力学研究[15]。近年来，随着液相色谱质谱技术的发展，高分辨质谱也被应用于多成分的定量。高分辨质谱特有的MRMHR 模式，不仅具有超高质量分辨率，也具有低分辨质谱多反应监测模式的准确度和灵敏度[16，17]。

本研究基于UPLC-Q/TOF-MS 法的MRMHR模式，建立虎杖中虎杖苷、白藜芦醇、大黄素的血药浓度分析方法，该方法具有分析时间短、专属性好和灵敏度高等特点。

在血浆样本前处理过程中，分别考察甄选甲醇、乙腈、乙酸乙酯和甲基叔丁基醚为提取试剂。蛋白沉淀法前处理快速便捷，但其选择性差，血浆中内源性基质可能影响待测成分的检测。液-液萃取法根据相似相溶原理，选择性好，可以去除大部分内源性基质的干扰，当溶剂挥干后可以达到富集待测物的目的。研究发现，甲基叔丁基醚对虎杖苷和白藜芦醇萃取效率不足70%，而乙酸乙酯对3 种待测物的萃取效率均可达到80%以上。本研究最终确定以乙酸乙酯液萃取。

虎杖调脂药效明确，研究其指标性成分虎杖苷、白藜芦醇、大黄素在疾病状态下的药代动力学特征，对于进一步揭示其药效物质基础和作用机制具有重要的意义。本研究建立的UPLC-Q/TOF-MS法同时检测高脂血症模型鼠灌服虎杖提取物后3种指标性成分的血药浓度。鉴于非房室模型限制性条件较少，只要求药物末端符合指数消除，不受房室模型的限制，适用于大多数药物[18]，因此选用非房室模式估算药代动力学参数。研究结果显示，高脂血症模型鼠灌服虎杖提取物后，3 种指标性成分可快速达到血药浓度峰值，平均达峰时间约为15 min。血药浓度-时间曲线显示，大黄素药-时曲线呈现双峰现象，这与文献报道一致[19]。肝肠循环是导致大黄素双峰现象的主要原因。在3 种指标性成分中，虎杖苷血药浓度最高，体内暴露量大，而大黄素血药浓度则相对偏低，体内暴露量亦较小。从反映药物在体内消除快慢和速率的参数t1/2和MRT 可知，虎杖指标性成分在高脂血症模型鼠体内消除较快。

综上所述，本研究基于UPLC-Q/TOF-MS 法的MRMHR 模式，建立了同时测定虎杖中虎杖苷、白藜芦醇、大黄素血药浓度的分析方法，并采用该方法初步探讨了高脂血症大鼠灌服虎杖提取物后3 种指标性成分的药代动力学特征，为进一步开展虎杖治疗高脂血症的药效物质基础和机制研究提供理论基础，为虎杖药用资源的深入开发提供依据。