施用生物菌剂对棉田土壤细菌群落多样性及种群结构的影响

刘海洋，王 伟，张仁福，雷 斌，姚 举

(1. 新疆农业科学院植物保护研究所/农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室，乌鲁木齐 830091；2.新疆农业科学院核技术生物技术研究所，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】新疆棉花种植面积占全国80%以上，长年连作会导致棉花根腐病、黄萎病等土传病害发生[1]。目前主要通过种植抗病品种防控土传病害，由于抗性种质资源缺乏以及病原菌致病力变异复杂，致使棉花品种抗病性容易丧失，增加了土传病害的防治难度。生物防治技术具有生态、无毒、促生、抑菌等优点，是目前防治棉花作物土传病害的研究热点。【前人研究进展】马平等从棉花根际分离到一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NCD-2，由该菌株研制的生物菌剂多年田间防治棉花黄萎病效果达70%以上[2,3]。解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)X-278[4]、B.axarquiensisTUBP1[5]、B.malacitensisZ-5[6]、甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus)LW-4[7]、死谷芽孢杆菌(B.vallismortis)HJ-5[8]等多株棉花病害拮抗菌株被挖掘出来，其中死谷芽孢杆菌HJ-5与有机肥合用对棉花黄萎病防效较好，并对土壤微生物区系有改善作用。研究表明，土壤微生物多样性与土传病害防治效果存在相关，调控土壤微生物群落结构或改变微生物功能多样性对土传病害有积极作用[9,10]。土壤细菌多样性受土壤类型、作物种类、种植模式等多种因素以及各因素复杂相互作用的影响显著[11-13]。【本研究切入点】土壤中的细菌群落及其结构变化能反映土壤生态环境的变化趋势，虽然目前防治棉花土传病害的生防菌株较多，但是缺乏商品化生产且大面积推广应用的防治棉花土传病害的生物菌剂，尤其关于生物菌剂施用后对土壤细菌群落多样性影响的研究较少。研究生物菌剂对棉田土壤细菌群落多样性及种群结构的影响。【拟解决的关键问题】研究新疆棉田施用以及减施化肥后土壤的微生物多样性和群落结构变化，分析该生物菌剂对新疆棉田土壤微生物多样性、种群结构的影响，以及其对土壤环境的改善作用，为提高棉花土传病害的生物防治水平和化肥减施技术理论提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌剂

供试抗重茬微生态菌剂(下称生物菌剂)由中农绿康(北京)生物技术有限公司生产提供，选用防病促生芽孢杆菌等高效菌株加工制备而成，有效活菌数≥5.0×108/mL。

1.1.2 土壤样品

2017～2019年在新疆农业科学院库尔勒农业有害生物防治野外科学观测试验站(E:85.807691，N:41.751360，下称试验站)分别采集施用生物菌剂棉田10～20 cm耕层的土壤，并采集相邻棉田或分割棉田土壤作为对照，备用。

1.2 方 法

1.2.1 样品采集

(1)2017年土壤样品采集

2017年7月4日在试验站棉花黄萎病病圃内设生物菌剂和清水对照2个处理，每处理随机排布3个小区，每个小区面积10 m2，试验前分别对2个处理(B-Biofer、B-ck)取样各3份，-80℃冰箱保存。于7月4日、7月14日、7月24日施用200倍菌剂3次，对照施用同量清水。于8月29日施用菌剂35 d后再分别对2个处理(Biofer、CK)各取样3份，-80℃冰箱保存，与试验前取的土壤样品送至北京百迈客生物科技有限公司进行高通量测序分析。

(2)2018年土壤样品采集

2018年在试验站内选择单块面积约15 000 m2棉田滴施生物菌剂(Biofer)，以相邻正常管理棉田为对照(CK)，6月15日随水滴施菌剂5 L/667m2，不施头水肥；对照棉田滴施头水肥(5 kg尿素，2 kg复合肥，2 kg黄腐酸)，于7月15日采集2个处理棉田土壤各5份，送北京百迈客生物科技有限公司进行高通量测序分析。

(3)2019年土壤样品采集

2019年在试验站内分别选择1号、2号2块棉田进行菌剂大田试验。

1号棉田面积约30 000 m2，6月18日随水滴施菌剂5 L/667 m2(Biofer1)，不施头水肥；以相邻正常管理棉田为对照(CK1，5 kg尿素，2 kg复合肥，2 kg黄腐酸)，于7月15日采集2个处理棉田土壤各5份。

2号棉田面积约30 000 m2，从棉田中间划分为滴施菌剂(Biofer2)和正常管理对照(CK2， 5 kg尿素，2 kg复合肥，2 kg黄腐酸)2个处理，6月18日、6月26日随水滴施菌剂2次，每667 m2滴施2.5 L/次，不施头水肥；于7月18日采集每个处理棉田土壤各5份，与1号棉田采集土样一起化验土壤养分和理化性质，并送北京百迈客生物科技有限公司进行高通量测序分析。

1.2.2 土壤理化性质测定

检验2019年试验站内采集的1号、2号2块棉田及对照棉田土壤理化性质。每块棉田5点土样混合成1份土样。将处理好的土壤样品送交新疆土肥水农业科技工程中心进行统一分析化验，指标包括pH值、总盐、有机质、全氮、全磷、全钾、速效氮、速效磷、速效钾。

1.2.3 土壤总DNA提取与文库构建、测序

利用北京百泰克生物技术公司生产的DP4001土壤试剂盒提取土壤总DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA质量，使用Nano Drop 2000 UV-Vis光谱仪测定DNA浓度，总量满足3次及以上建库要求。所用引物为细菌16S rDNA (V3+V4)区域引物，338F：5'- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；806R：5'- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。PCR扩增程序：98℃预变性2 min；98℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，25个循环；72℃延伸5 min。由北京百迈客生物科技有限公司构建DNA文库，采用Illumina Hiseq 2500 PE250模式进行测序。

1.3 数据处理

对测序获得的原始数据使用FLASH V1.2.7软件对每个样品的序列进行拼接得到原始序列，用Trimmomatic软件过滤质控后长度小于标签长度75%的标签，使用UCHIME软件去除嵌合体得到高质量的序列。在相似性97%的水平上使用UCLUST软件对序列进行聚类。在细菌16S Silva数据库进行比对，在置信度阈值为0.8利用RDP Classifier软件进行物种注释分类。利用Mothur version V.1.30软件进行Alpha多样性指数分析，包括ACE指数、Chao1指数、香农-威纳指数；基于Bray curtis多种算法呈现物种多样性矩阵，进行Beta多样性分析(n≥3)。利用LEfSe分析方法设定显著差异的LDA值为4.0，寻找组间丰度差异显著物种。

利用Excel软件对常规数据进行整理、汇总，利用SPSS19.0软件的ANOVA程序中的Duncan程序对数据进行单因素方差分析，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 施用生物菌肥对棉田土壤理化性质的影响

研究表明，库尔勒试验站棉田土壤偏强碱性，2019年试验站Biofer1、Biofer2棉田仅施生物菌剂而停施头水肥使土壤总盐、全氮、有机质、速效磷、速效钾等指标均下降，其中全氮、有机质、速效钾分别较对照降低28.7%、27.5%和31.9%，下降幅度较大；全磷、速效氮含量与对照田相比没有下降，其中全磷、速效氮在1号棉田含量较其对照田分别高0.28 g/kg和3.0 mg/kg；全钾在Biofer2棉田中含量高于其对照，在Biofer1棉田中略低于其对照，均无显著差异。表1

表1 2019年试验田土壤养分与理化性质Table 1 Soil nutrients and physicochemical properties of the experimental plots in 2019

2.2 施用生物菌剂棉田土壤细菌多样性指数的影响

研究表明，2017年小区内生物菌剂施用前土壤细菌多样性接近，无显著差异，施用后土壤细菌多样性变化趋势一致但仍无显著差异，但Shannon多样性指数由低于对照转为高于对照。2018年大田施用生物菌剂且停施头水肥后，土壤中细菌的ACE、Chaol指数均低于对照，而Shannon多样性指数略高于对照，处理间未达显著差异。2019年大田试验1、2号棉田土壤细菌多样性指数与2018年趋势一致，ACE、Chaol指数均显著(P<0.05)低于对照，而Shannon多样性指数略高于对照。停施头水肥显著降低了土壤细菌的丰富度，而施用生物菌剂则增加了土壤细菌的多样性，但影响不显著。表2

表2 生物菌剂不同年份施用后棉田土壤细菌多样性指数Table 2 Diversity index of soil bacteria in cotton field after applying biofilm in different years

2.3 不同处理棉田土壤细菌群落聚类

研究表明，2017年小区试验前土壤样品B-CK1、B-CK2、B-Bio3、B-Bio2、B-CK3、B-Bio1交互聚为一支，细菌群落结构相似性较高；施用菌剂后处理Bio1、Bio2、Bio3单独聚为一个亚枝，与清水对照CK组土壤细菌群落结构差异变大(图1a)，施用菌剂在一定程度上影响了土壤细菌群落结构。2018年、2019年施用生物菌剂处理与相邻常规管理对照棉田土壤细菌群落组成差异较大(图1b、图1c)，而2019年同一棉田分割而成的施用菌剂与常规管理2个处理各样品交互聚类到一起，土壤的细菌群落组成相似性较高(图1d)，施用生物菌剂对土壤细菌群落结构的影响较小；不同棉田的土壤背景差异可能是造成生物菌剂处理与相邻常规管理对照棉田土壤细菌群落差异较大的原因。图1

注：a:2017年试验站病圃各处理土壤；b:2018年试验站各处理土壤；c：2019年试验站1号棉田各处理土壤；d：2019年试验站2号棉田各处理土壤

2.4 不同处理棉田土壤细菌群落的组间差异

研究表明，当LDA值≥4.0时，2017年小区试验菌剂处理Biofer与清水对照存在5个显著差异标记，其中Biofer组中芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes)显著高于CK组，而CK组中厚壁菌门(Firmicutes)、梭菌纲(Clostridia)、梭菌目(Clostridiales)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)显著高于Biofer组。2018年大田试验CK组中变形菌门(Proteobacteria)显著高于Biofer组(2018)，而Biofer组(2018)中没有显著差异标记。2019年大田试验中Biofer1与CK1、Biofer2与CK2之间均没有显著差标记菌株，施用生物菌剂未显著改变土壤细菌群落结构。图2

注：a:2017库尔勒棉花病圃各处理土壤；b:2018年试验站各处理棉田土壤；c：2019年试验站1号棉田各处理土壤；d：2019年试验站2号棉田各处理土壤

2.5 不同处理棉田土壤拮抗细菌属的丰度

研究表明，2017年小区试验前土壤中芽孢杆菌属(Bacillus)丰度为0.1%～0.12%，菌剂处理后，相对于清水对照(0.15%)菌剂处理土壤中芽孢杆菌属的丰度(0.21%)由试验前低于对照变为高于对照。2018年Biofer处理土壤中芽孢杆菌属的丰度为1.72%，较其对照(1.30%)高0.42个百分点。2019年Biofer1处理土壤中芽孢杆菌属的丰度为2.78%，较其对照(1.01%)高1.77个百分点；Biofer2处理土壤中芽孢杆菌属的丰度为3.43%，已成为土壤中的优势均属，较其对照(2.48%)高0.95个百分点。

链霉菌属(Streptomyces)的丰度在Biofer(0.48%)与CK(0.44%)处理之间以及Biofer1(0.20%)与CK1(0.18%)处理之间均相差不大，在Biofer(0.74%，2018)处理中丰度低于CK(1.22%，2018)，而在Biofer2(0.15%)的丰度是CK2(0.06%)的2.5倍。

溶杆菌属(Lysobacter)的丰度在Biofer(0.28%，2017)和CK(0.27%，2017)处理之间、Biofer(1.31%，2018)和CK(1.14%，2018)之间以及Biofer1(0.10%)与CK1(0.11%)处理之间均相差不大，但在Biofer2(0.60%)处理的丰度是CK2(0.05%)的12倍。

假单胞菌属(Pseudomonas)在Biofer(0.37%，2017)与CK(0.40%，2017)处理之间、Biofer(1.64%，2018)处理与CK(2.59%，2018)之间、Biofer1(0.48%)处理与CK1(0.63%)之间以及Biofer2(0.83%)与CK2(0.87%)处理之间丰度值均相差不大。

芽孢杆菌属的丰度在所有处理中均高于对照，而假单胞菌属的丰度在所有处理中均低于对照，溶杆菌属、链霉菌属在不同处理中无一致规律。表3

表3 4种主要细菌种群在不同处理土壤中的丰度值Table 3 Abundance values of 4 major bacterial populations in soils of different treatments

3 讨 论

研究认为，有机施肥、生物菌剂通过有效菌株在土壤、作物根表、根际、体内定植后繁殖和转移，发挥菌株的固氮、解磷、抗病、改良土壤等功能，其在定植、繁殖过程中会对土壤微生物群落产生影响[14]。研究发现施用生物菌剂而停施头水肥后土壤中全氮、有机质、速效钾含量下降幅度较大，但是全磷、速效氮含量没有下降，土壤肥力表现出一定程度的盈余，后期可根据土壤中肥力指标变化程度制订准确的减肥措施。此外，施用生物菌剂、停施头水肥后土壤细菌的丰富度显著降低，而细菌的多样性一定程度上增加了，但是并不显著。土壤pH值、电导率以及碱解氮、有效磷含量等多种因素与土壤细菌群落结构的变化有关[15-16]，可能由于化肥减量造成部分土壤理化性质指标降低影响了土壤中细菌的丰度；但是高量施氮亦会导致土壤次生盐碱化和酸化，降低土壤细菌系统类型丰富度和系统发育多样性[17]，适量施肥尤为重要。生物菌剂在不减化肥情况下能够一定程度上影响土壤微生物群落组成，在减施化肥的情况下，这种改变程度会降低，相邻棉田群落结构差异大的原因可能主要受土壤来源因素影响，因为相邻田块不同的pH、电导率可能影响了土壤细菌群落结构和多样性[18-19]。

生物菌剂(生物肥、有机肥[20])通过增加土壤中有益菌群的丰度改善土壤微生物群落结构并达到防控土传病害的目的。Sui等[21]用多粘类芽孢杆菌CP-S316发酵液处理杨树后，其根际土壤中真菌的OTUs、Chao指数显著降低，但是拮抗菌芽孢杆菌属的比例较对照增加2.8个百分点，CP-S316改善了杨树根际微生物群落结构。Li等[22]施用生物肥显著增强了土壤微生物的酶活性以及芽孢杆菌、木霉菌、假单胞菌等拮抗细菌的丰度。Chen等[23]施用有机肥后花生根际细菌菌群的聚集抑制了镰刀菌菌丝生长和孢子萌发，对土壤抑制花生根腐病起关键作用，而化学施肥下潜在的真菌病原体在根际真菌菌群中占主导地位，促进了花生根腐病的发生。分析发现，施用生物菌剂且停施头水肥与常规管理棉田土壤细菌种群之间显著差标记较少，且2019年大田试验发现没有显著差标记。土壤中拮抗菌群丰度的变化是研究关注的重点，研究中芽孢杆菌属的丰度在施用生物菌剂土壤中均高于对照，呈现出逐年增加的趋势，与Sui等[21]、Li等[22]部分研究结论一致。研究发现假单胞菌属的丰度在所有的处理中均低于对照，溶杆菌属、链霉菌属的丰度在不同处理中无一致规律，并没有随施用生物菌剂而增高，与Li等[22]施用有机肥后木霉菌、假单胞菌等拮抗细菌升高不同，可能与生物肥、生物菌剂不同作用的机制所致。

部分生物菌剂对土壤微生物群落无明显影响，Shin等[24]报道商品微生物菌剂EM-bokashi施用后未改变土壤细菌群落和多样性，其认为EM中添加的微生物可能具有竞争性但不影响现有的细菌群落，EM并没有持续抑制土壤传播疾病或改变微生物活性、细菌组成和多样性。Giotis等[25]也发现以枯草芽孢杆菌、寡雄腐霉和海藻提取物等为基础的生物防治产品对土壤传播疾病、土壤生物活性没有积极影响。Lihua等[26]将生防菌株枯草芽孢杆菌B068150接种于壤土、沙土和粘土后没有显著改变3种土壤中黄瓜根际微生物群落的多样性，尤其在粘土中B068150的种群密度与黄瓜根际细菌多样性显著负相关，其认为土壤类型可能参与了生物菌剂对微生物群落的调控。Larkin等[27]研究表明，商业和研究用的生物菌剂、微生物接种剂等虽然显著影响土壤微生物群落特性，但影响效应低于轮作效应，某些轮作能够更好地支持从改良剂中添加的有益菌群，使生物防治更有效，在改变土壤微生物群落特性方面，有利的作物轮作可能比改良剂更有效。研究中生物菌剂虽然在一定程度上增加了土壤中芽孢杆菌属的丰度，但是未能显著影响土壤细菌的群落结构，可能与土壤类型、作物种类、土壤理化性质、施用周期等因素有关，在新疆棉花单耕作系统中，持续施用生物菌剂有利于作物根际微生物保护层的形成，维持作物根际的健康。

4 结 论

棉田施用生物菌剂停施头水肥后土壤全氮、有机质、速效钾含量分别下降28.7%、27.5%和31.9%，下降幅度较大；而全磷、速效氮含量未下降；土壤细菌的丰富度(ACE、Chaol指数)显著降低，Shannon多样性无显著变化。施用生物菌剂与常规管理棉田之间土壤细菌种群显著差标记较少，对土壤细菌群落组成影响不显著。土壤中有益菌芽孢杆菌属的丰度呈现出逐年增加的趋势，Biofer2处理升高38.3%；假单胞菌、溶杆菌、链霉菌等菌属的丰度并未随施用生物菌剂而增高。生物菌剂未能显著影响土壤细菌的群落结构可能与土壤类型、土壤理化性质、生物菌剂施用技术等因素有关。