NaCl胁迫下不同铵、硝配比对小麦抗氧化酶活性的影响

乔 旭，高永红，赛力汗·赛，薛丽华，张永强，陈传信，肖 丽，雷钧杰

(1.新疆农业科学院粮食作物研究所/农业部荒漠绿洲作物生理生态与耕作重点实验室，乌鲁木齐 830091；2.中国医学科学院/北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；3.新疆农业科学院科研管理处，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】氮素是促进作物生长发育与产量形成中最重要的元素[1]。不同氮素形态与作物氮素营养生理特性及其生长发育有密切关系[1-3]。铵硝混合营养较单纯的铵营养或硝营养更能获得高产，如在大麦[4]、小麦[5]、棉花[6]、菠菜[7]、小白菜[8]等作物上的研究均证实铵硝混合营养优于单纯的铵营养或硝营养。植物吸收同化每分子的铵态氮所消耗的能量低于等当量的硝态氮[2, 9]。【前人研究进展】盐胁迫可使植物体内自由基积累量上升，产生大量活性氧化物，加强膜脂过氧化作用。丙二醛作为膜脂过氧化产物，通过破坏植物细胞膜的透性，影响植物各种生理代谢，对细胞造成损伤。但细胞中存在一系列的保护酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POX)、抗坏血酸过氧化物酶(APX) 和过氧化氢酶(CAT) 等，可在盐胁迫时增强活性，加快对活性氧的清除，维持活性氧代谢平衡，保护膜的结构和功能[3, 5, 7]。铵硝混合营养对植物抵御逆境胁迫所造成的不利影响有显著的促进作用，如水稻[3, 10]、大麦[4]、高羊茅[11]和番茄[1]等。【本研究切入点】关于盐分(NaCl) 胁迫下不同氮素形态配比对小麦体内抗氧化酶活性的研究尚未见报道。土壤次生盐渍化始终是威胁新疆绿洲农田土壤质量和限制作物产量的主要障碍因素。亟需研究盐分胁迫下不同铵硝配比对小麦逆境生理特性的影响。【拟解决的关键问题】分析减轻盐分胁迫对小麦幼苗伤害的可实现途径，调控铵硝营养供给增强小麦幼苗在盐分胁迫最敏感阶段的抗性，促进小麦的早发，为盐分胁迫与氮素营养互作机制的逆境生理学提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验在中国农业大学资源与环境学院温室内进行。采用蛭石为介质的水培培养，微量元素参照Hammer et al. (1989)的方法配制，在营养液中加入占总氮量3%的硝化抑制剂 (Dicyandiamide, DCD)。供试小麦品种为新冬20号。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

设不同水平NaCl (0、100、200 mmol/L和NH4+/NO3-(0/100、25/75、50/50、75/25、100/0)，用总氮水平为5.0 mmol/L略加修改的Hoagland营养液，每个处理重复3次。播种之前选择均匀、饱满的种子晒种2 d，用10%的双氧水对种子消毒10 min，蒸馏水冲洗干净。将种子播种在12 cm×12 cm的培养钵内，把培养钵置于长45 cm、宽33 cm、高20 cm的保险盒中，每个保险盒中放置12个培养钵，出苗以前用去离子水浇灌。当小麦出苗3 d后开始采用1/4浓度营养液培养3 d，然后换用1/2营养液培养3 d，9 d后用全营养液培养。出苗16 d后盐分处理，每12 h增加50 mmol/L NaCl营养液培养幼苗，直到最终浓度为0、100和200 mmol/L。所有的营养液每3 d更换1次，每天用去离子水补充由于蒸发及蒸腾作用所损失的水分。在培养的过程中，用0.1 mmol/L的NaOH或HCl调节营养液pH值至5.8～6.0。

在盐分处理73 d时每个重复分别取4个培养钵的小麦收获，测定其生物量；取4个培养钵小麦的倒三叶和倒四叶，立即在液氮中速冻10 min，迅速转移至-80℃超低温冰箱中冷冻储藏。

取样：在盐分处理55 d时，每个处理的每个重复随机选定4株幼苗，取根系根尖吸干后测定根系活力。

1.2.2 测定指标

根系活力：称取根尖样品0.5 g，放入10 mL烧杯中，加入0.4% TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10 mL，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1～3 h，此后加入1 mol/L硫酸2 mL，以停止反应。将根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3～4 mL和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出甲月替。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2、3次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10 mL，用分光光度计在波长485 nm下比色测定。

质膜透性：参考Tuna等[12]的方法。小麦倒三、倒四叶用去离子水清洗3次以去除叶片表面粘附的电解质，用直径10 mm的打孔器避开主脉取样，混合均匀，每个重复取6片放入50 mL三角瓶中，装30 mL去离子水，25℃下在SHZ-82型恒温振荡器中振荡24 h 后测定1次电导率(Lt)，然后煮沸20 min，用流动自来水迅速冷却，然后立即测量各处理的煮后电导率(Lo)。

质膜透性(%)=Lt/Lo×100%。

酶液提取：称取0.400～0.450 g叶样，加入少许石英砂，1% PVPP (w/v%)，分次加入8 mL 50 mmol/L pH 6.8磷酸缓冲液于冰浴上研磨成均浆，10 000×g 4℃下离心20 min，上清液用于SOD、POX和APX活性的测定。

SOD活性：参照Meloni et al[13]的方法。3 mL的反应混合液中含50 mmol/L pH 7.8磷酸钠缓冲液，2 μmol/L的核黄素，13 mmol/L甲硫氨酸，75 μmol/L氮蓝四唑(NBT)，0.1 μmol/L EDTA，100 μL的粗酶液，在3 000 lx下光照10 min，测定560 nm下的OD值。以抑制NBT光还原50%的酶量作为一个酶单位。

POX活性：参照李合生[14]的方法。3 mL的反应混合液中含50 mmol/L pH 6.8磷酸缓冲液，20 mmol/L愈创木酚，20 mmol/L H2O2，100 μL的粗酶液，在30℃水浴中保温3 min，测定480 nm下的OD值，每隔1 min读数1次。以1 min OD480降低0.01为一个酶活单位，酶的比活力以Units/mg protein/min表示。

APX活性：参照Yazici et al[15]方法。1 mL的反应混合液中含50 mmol/L pH 7.0磷酸钠缓冲液，0.5 mmol/L抗坏血酸，0.1 mmol/L EDTA Na2，1.0 mmol/L H2O2，100 μL的粗酶液，测定290 nm下单位时间内酶活性的变化。酶的比活力以Units/mg protein/min表示。

1.3 数据处理

试验数据采用Excel，SigmaPlot和SPSS 16.0统计分析软件进行处理, 处理间的差异显著性采用Duncan进行单因素多重比较。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫和不同铵硝配比对小麦生物量的影响

研究表明，铵硝混合营养处理对小麦生物量具有显著的影响 (P<0.05)，小麦生物量在纯铵营养下最高，纯硝营养下最低，不同铵硝营养处理对小麦生物量影响的表现效果顺序NH4+/NO3-为100/0>75/25>50/50>25/75>0/100。在0、100和200 mmol 3个NaCl水平下，小麦生物量均表现为纯铵营养处理 (NH4+/NO3-为100/0) 显著高于纯硝营养处理 (NH4+/NO3-为0/100) (P<0.05)。小麦生物量受盐分胁迫影响均达到显著水平 (P<0.05)。表1

表1 不同水平NaCl和不同水平NH4+/NO3-下小麦生物量变化 (g/株)Table 1 The effect of NaCl and NH4+/NO3- treatments on total dry weight of wheat seedlings(g/plant)

2.2 NaCl胁迫和不同铵硝配比对小麦根系活力的影响

研究表明，在盐分胁迫和非盐分胁迫条件下，随着营养液中铵比例的增加小麦根系活力均显著增大，在纯铵营养下达到最大，NH4+/NO3-为100/0>75/25>50/50>25/75>0/100。盐分胁迫明显降低了小麦的根系活力，但增铵营养减轻了这种胁迫作用。一定比例的铵硝混合营养能提高根系活力，促进小麦的生长。图1

注：图中不同字母均表示在 (P<0.05) 水平上差异显著，下同

2.3 NaCl胁迫和不同铵硝配比对小麦质膜透性的影响

研究表明，在0、100和200 mmol NaCl浓度下，铵硝混合营养 (NH4+/NO3-为75/25) 和纯铵营养处理小麦叶片质膜透性明显低于纯硝营养处理。200 mmol NaCl浓度下，NH4+/NO3-为75/25和纯铵营养处理的质膜透性分别比纯硝营养处理低3.1%和3.6%。图2

图2 不同水平NaCl和不同水平NH4+/ NO3-下小麦质膜透性变化Fig.2 The effect of NaCl and NH4+/ NO3-treatments on electrolyte leakage of wheat seedlings

2.4 NaCl胁迫和不同铵硝配比对小麦保护酶活性的影响

研究表明，小麦叶片中的SOD和APX活性均随着盐分浓度的增加显著降低；随着铵比例的增加显著增大，在纯铵营养下达到最大值。0、100和200 mmol NaCl浓度下，纯铵营养(NH4+/NO3-为100/0) 处理叶片SOD活性分别比纯硝营养 (NH4+/NO3-为0/100) 处理高60.7%、104.8%和115.5%。

随着盐分浓度的增加小麦叶片POX活性显著降低，而随着铵比例的增加POX活性显著增大，0、100和200 mmol/L NaCl浓度下，纯铵营养 (NH4+/NO3-为100/0) 处理小麦叶片POX活性分别比纯硝营养 (NH4+/NO3-为0/100) 处理高143.2%、130.7%和181.7%。图3

图3 不同水平NaCl和不同水平NH4+/ NO3-下小麦体内抗氧化酶活性变化Fig.3 The effect of NaCl and NH4+/ NO3-treatments on the antioxidative enzyme activities of wheat seedlings

3 讨 论

虽然NH4+-N 和NO3--N 都能被植物迅速吸收，但所消耗的能量不同，植株吸收1分子的NO3--N 时消耗20份的ATP，而吸收NH4+-N 时只需消耗5份ATP，在根系中每吸收同化1分子的NH4+-N比NO3--N节约8%～12%，在茎秆中将节省3%～6%[2]。当使用混合态N 时，将会节省更多能量来抵御逆境胁迫所造成的不利影响，有益于植物在各种逆境生态条件下的生长。如董海荣等[6]和Meloni等[13]研究表明，铵硝混合营养优于单纯的铵营养或硝营养。试验表明，随着营养液中NH4+-N比例的增加, 小麦总生物量呈增加的趋势，与前人研究结果相似[5, 14-15]，在以硝态氮为主要氮源的旱地通过增铵营养对小麦苗期生长有促进效应。

在逆境胁迫下，植物依赖其体内存在的活性氧清除系统(保护酶系统和抗氧化剂系统) 之间相互协调来维持自由基生成与消除的动态平衡，但若胁迫强度超过“阈值”后，则会造成细胞内代谢失调，自由基逐渐积累，引起膜质过氧化作用加剧，造成质膜透性增大，导致细胞膜结构和功能的损伤[3-4]。试验结果表明，相对于纯硝营养，通过增铵营养在一定程度上能提高根系活力，从而减小膜脂过氧化作用，促进作物的生长，提高作物的抗逆境胁迫能力。在3个盐分浓度梯度下，纯铵营养处理小麦根系活力显著高于纯硝营养处理。

4 结 论

在盐分胁迫和非盐分胁迫条件下，相对于纯硝营养，通过增铵营养在一定程度上能提高小麦根系活力，提高其抗氧化酶 (SOD、POX和APX) 活性，减轻盐分胁迫所导致的细胞膜脂过氧化作用，提高植物的抗逆境胁迫能力。随着盐分浓度的增加小麦质膜透性显著增大，而根系活力、SOD、POX和APX活性则随着盐分浓度的增加显著降低 (P<0.05)。在盐分胁迫条件下，铵硝混合营养 (NH4+/NO3-为75/25) 和纯铵营养最有利于小麦的生长发育，可提高其抗逆境胁迫能力，减弱盐分胁迫对小麦的伤害。