皮层肌动蛋白通过与Src相互作用促进食管鳞状细胞癌的侵袭和转移

张九娜 翟 山 杨 阳 郭永泽 李校天

食管鳞状细胞癌(简称鳞癌)是我国常见的消化系统恶性肿瘤之一，由于早期食管鳞癌缺乏典型的临床症状，发现时往往已进展至中晚期，失去最佳手术时机，只能采取手术结合放射和(或)化学治疗的综合治疗方案，癌细胞转移是食管鳞癌治疗的最大障碍[1-2]。癌细胞的迁移侵袭能力是其转移最重要的环节。癌细胞迁移侵袭的环节包括细胞黏附减少、细胞骨架重排、细胞外基质降解，以及细胞突触及伪足形成，其中伪足尤其是片状伪足的形成是癌细胞迁移侵袭的关键[3]；皮层肌动蛋白(cortactin, CTTN)能够促进片状伪足的形成并维持其稳定[4-5]。研究[6]发现，CTTN在结肠癌中通过激活表皮生长因子受体(EGFR)-细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路促进结肠癌的发展，其在结肠癌中的高表达与肿瘤分期和淋巴结转移呈正相关。前期研究[7]发现，CTTN不仅在食管鳞癌中高表达，而且与肿瘤病理分期和患者不良预后显著相关；因此推测，CTTN可能调控食管鳞癌的侵袭转移。关于CTTN在食管鳞癌侵袭转移中的研究较少，本研究旨在探讨CTTN在食管鳞癌侵袭转移中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 人食管鳞癌细胞系EC109、TE1购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；兔抗细胞间黏附分子-1(ICAM1)、基质金属蛋白酶(MMP)2、血管内皮生长因子C(VEGF-C)、GADPH单克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；兔抗MMP9、CTTN单克隆抗体、小鼠抗Src单克隆抗体购自美国Abcam公司；荧光标记的羊抗兔二抗、羊抗小鼠二抗购自美国LI-COR公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、传代及冻存 将EC109、TE1细胞置于含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI 1640完全培养基中，于体积分数为0.05的 CO2孵箱中37 ℃恒温培养。当细胞融合度达到80%～90%时，以常规胰酶消化、传代，取处于对数生长期的细胞用于实验。暂不用的细胞按常规流程予以冻存。

1.2.2 慢病毒的构建 用于过表达或敲减CTTN的慢病毒载体由上海吉玛制药技术有限公司构建。采用LV17慢病毒载体过表达CTTN，元件为EF-1a-CMV-luci17-T2A-puromycin，插入的载体序列为5’-GGC GAA TTC TGA TGT-3’和5’-GGA AAG CCT CTG C-3’。 采用LV16 (U6/Lucifer-ase17&Puro) 慢病毒载体干扰CTTN的表达，元件为U6-CMV-/Luc17-T2A-puromycin，插入载体序列为5’-CCA TGG CT-3’和5’-ATG GAG GGA AAT T-3’。两个载体的对照载体插入序列均为5’-TTC TCC GAA CGT GTC ACG T-3’。

1.2.3 慢病毒转染实验及稳定细胞株的筛选 根据上海吉玛公司提供的慢病毒使用说明书，用上述载体对EC109、TE1细胞进行转染，用嘌呤霉素筛选稳定细胞株。将EC109、TE1细胞分别分为4组：过表达组(即LV-CTTN组)、空白对照组(即LV-NC组)、敲减组(即LV-sh-CTTN组)和阴性对照组(即LV-sh-NC组)。经嘌呤霉素筛选后的稳定细胞检测过表达和抑制效果。

1.2.4 蛋白质印迹法(Western blotting)检测CTTN及侵袭转移相关蛋白质 常规收集细胞，裂解提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白质浓度。采用12%分离胶电泳，聚二偏氟乙烯(PVDF)膜湿转法转膜， 5%脱脂奶粉封闭。根据抗体说明书用TBST缓冲液稀释一抗： ICAM1(1∶1 000)、MMP2(1∶500)、VEGF-C(1∶1 000)、GAPDH(1∶3 000)、CTTN(1∶50 000)。荧光二抗用TBST缓冲液按1∶20 000稀释，于室温避光孵育1 h，最后采用Odyssey双色红外激光成像系统进行扫描。根据相应分组，实验至少重复4次。

1.2.5 Transwell侵袭实验 常规消化稳定转染的TE1细胞，弃去培养基，洗涤2次，后将细胞重悬于含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的无血清培养基中，调整细胞密度为5×106/mL，取200 μL的细胞悬液接种于包被好的Transwell小室的上室中， 24孔板下室加入600 μL含15% FBS的培养基，上下室之间避免产生气泡。在培养箱中培养24 h。取出Transwell小室，用棉签擦净上室内未侵袭的细胞，PBS缓冲液洗2次，4%多聚甲醛固定 20 min，0.1%结晶紫染色 15 min，PBS缓冲液洗2次，显微镜下计数迁移的细胞数。每组设置2个复孔，实验重复3次。

1.2.6 划痕试验 将筛选后稳定转染的TE1细胞接种于6孔板中，待细胞融合度达到80%～90%时，用200 μL枪头在培养板上做线性划痕。PBS缓冲液洗3次，加入无血清培养基，于倒置显微镜下拍摄初始划痕作为起始时间点(0 h)，培养48 h为终点拍摄划痕的变化情况，测定迁移后的剩余距离。以[(初始划痕距离-迁移的剩余距离)/初始划痕距离]×100%表示划痕愈合速度。每组设置3个复孔，试验重复3次。

1.2.7 免疫共沉淀 制备EC109细胞裂解液样本，将其分为4组：Input对照组、阴性对照组、IgG组、CTTN组。Input对照组加入上样缓冲液煮沸变性后备用;阴性对照组、IgG组和CTTN组各加入15 μL蛋白 A、蛋白G琼脂糖珠，低温摇床孵育预清除，离心取上清液;IgG组和CTTN组分别加入相应的抗体(兔IgG 0.2 μL，兔CTTN 2 μL)，4 ℃摇床过夜；加入30 μL磁珠，低温摇床孵育4 h；低温离心弃上清液，用免疫沉淀反应(IP)洗脱缓冲液洗涤3次，弃上清液；最后加入20 μL 2×上样缓冲液煮沸后行蛋白质印迹法实验，用小鼠Src抗体封闭。反之，用Src抗体进行沉淀反应，也分为Input对照组、阴性对照组、IgG组、Src组，IgG组和Src组分别加入小鼠IgG和小鼠Src抗体。沉淀产物行蛋白质印迹法实验，用兔CTTN抗体封闭检测。实验重复3次。

2 结 果

2.1 慢病毒转染效果验证 蛋白质印迹法实验结果显示，EC109和TE1细胞的LV-CTTN组CTTN相对表达量分别为3.92±0.21、5.12±0.19，均显著高于各自LV-NC组 (1.62±0.24、1.43±0.22，P值均<0.001)，见图1A。EC109和TE1细胞的LV-sh-CTTN组CTTN相对表达量分别为0.31±0.11、0.43±0.09，均显著低于各自LV-sh-NC组(1.59±0.17、1.47±0.15，P值均<0.001),见图1B。

图1 慢病毒在食管鳞癌细胞系中成功过表达或敲减CTTN

2.2 CTTN调控侵袭转移相关蛋白质的表达 蛋白质印迹法实验结果显示，EC109和TE1细胞的LV-CTTN组ICAM1、MMP2、MMP9、VEGF-C相对表达量均显著高于各自LV-NC组(P值均<0.01)，见表1、图2A。EC109和TE1细胞的LV-sh-CTTN组ICAM1、MMP2、MMP9、VEGF-C相对表达量均显著低于各自LV-sh-NC组(P值均<0.01)，见表2、图2B、。

表1 EC109和TE1细胞过表达CTTN后各侵袭转移指标的相对表达量比较

表2 EC109和TE1细胞敲减CTTN后侵袭转移指标的相对表达量比较

图2 过表达或敲减CTTN对ED109、TE1细胞侵袭转移相关蛋白质表达的影响

2.3 CTTN促进TE1细胞侵袭行为 应用Transwell侵袭实验评估过表达和敲减CTTN对TE1细胞侵袭行为的影响，结果显示，LV-CTTN组的穿膜细胞数显著多于LV-NC组 [(541.0±17.8)个比(230.8±10.9)个，P<0.001]，见图3A、3B；而LV-sh-CTTN组穿膜细胞数显著少于LV-sh-NC组[(102.3±4.0)个比(223.8±12.1)个，P<0.001]，见图3C、3D。

A LV-NC组 B LV-CTTN组 C LV-sh-NC组 D LV-sh-CTTN组

2.4 CTTN促进TE1细胞迁移行为 划痕试验结果显示，TE1细胞的LV-CTTN组划痕愈合速度较LV-NC组加快[(72.8±1.9)%比(42.8±1.6)%，P<0.001]，见图4A；而LV-sh-CTTN组划痕愈合速度较LV-sh-NC组明显减慢[(25.7±1.5)%比(43.5±1.9)%，P<0.001]，见图4B。

图4 过表达或敲减CTTN对TE1细胞迁移能力的调控(标尺=200 μm)

2.5 CTTN促进食管鳞癌迁移侵袭的分子机制 免疫共沉淀检测结果发现，应用CCTN抗体进行沉淀反应，沉淀产物以Src抗体封闭，行蛋白质印迹法分析见明显的Src特异性条带，见图5A。反之，以Src抗体进行沉淀反应，沉淀产物以CCTN抗体封闭， 行蛋白质印迹法分析见CCTN特异性条带，见图5B。提示CCTN与Src之间存在直接相互作用。

图5 CTTN与Src存在相互作用

3 讨 论

侵袭和转移能力是衡量肿瘤细胞恶性程度的重要生物学特征，也是肿瘤治疗失败的主要原因。肿瘤的侵袭和转移是一个多因素、多步骤的复杂过程，涉及细胞间黏附减少、基质降解、细胞骨架重排，以及细胞突出和伪足的形成等诸多环节，是肿瘤细胞、间质细胞、细胞外基质三者之间一系列复杂调控的结果。

CTTN(又称EMS1)基因位于11q13,最初作为酪氨酸磷酸化蛋白被发现，在多种癌症如卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、下咽癌及头颈部鳞癌中异常表达,并与患者的不良预后相关[3-4,6-9]。CTTN因其自身结构特征在癌症中主要发挥促进侵袭、转移的作用，但也有研究[10]报道CTTN能促进癌细胞增殖并抑制其凋亡。侵袭性伪足是癌细胞侵袭过程中特有的突出结构，其能降解基底膜和细胞外基质。大量的研究[5，11]证实，CTTN作为侵袭性伪足组成成分通过促进癌细胞侵袭性伪足形成，维持其稳定，进而调控侵袭转移。本研究中，蛋白质印迹法分析结果显示，过表达CTTN后，降解细胞外基质成分的MMP2、MMP9和介导细胞黏附的ICAM1表达增高；同时Transwell实验及划痕试验也显示过表达CTTN后食管鳞癌细胞侵袭迁移能力增强。而敲减CTTN后不仅ICAM1、MMP2、MMP9表达降低，而且Transwell小室的细胞数明显减少，划痕愈合速度也明显减慢。肿瘤新生血管的形成对肿瘤的远处转移至关重要，有研究[12]结果表明，CTTN的高表达能抑制血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、EGFR1生长因子受体等的降解，进而促进肿瘤新生血管的生成。本研究发现，过表达CTTN后VEGF-C表达增加，敲减CTTN后VEGF-C表达减少。综上说明CTTN通过上调ICAM1、MMP2、MMP9及VEGF-C促进食管鳞癌细胞迁移及侵袭。

CTTN最常见的修饰是酪氨酸磷酸化和丝氨酸/苏氨酸的磷酸化。酪氨酸磷酸化常发生在Y421、Y466和Y488。CTTN作为Src磷酸化的底物，被Src磷酸化后发生活化，活化的CTTN分子能够作为支架蛋白维持Arp2/3复合物的稳定，进一步促使肌动蛋白(actin)在细胞前缘形成树突状网络结构即片状伪足和侵袭性伪足调控，从而调控细胞侵袭、转移[13]。CTTN已经被证实在多种癌症的侵袭、转移中发挥重要作用[6,14-15]。有研究[16-17]报道，Src通过与CTTN相互作用并使其发生酪氨酸磷酸化，进而促进乳腺癌侵袭和转移。为了探究CTTN调控食管鳞癌侵袭、转移的分子机制，本研究通过免疫共沉淀实验验证CTTN与Src的相互作用，结果提示在食管鳞癌中CTTN通过与Src相互作用促进侵袭和转移。