血管生成标志物在进行期银屑病皮损中的表达

冯 雷 黄美兴 雷水生 方培炫 朱 璐

银屑病是一种在多基因遗传背景下，由免疫反应介导的炎症性皮肤病，其患病率约为0.1%～3.0%[1-2]。银屑病常合并其他系统异常(如伴内脏及关节损害等),治疗难度大。中、重度银屑病患者罹患代谢综合征和动脉粥样硬化性心血管疾病的风险增加，严重危害其身心健康。银屑病主要的病理学表现为表皮角化过度伴角化不全，真皮乳头层毛细血管扩张，炎症细胞浸润明显[3-4]。银屑病以角质形成细胞异常增殖、分化和血管增生为基础，皮损处最先发生的病理学改变为血管分布和形成的异常。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在血管生成过程中起中心调控作用[5]。研究[6]发现，CD31和CD34是较理想的血管内皮细胞标志物，可有效标记和检测肿瘤新生血管的微血管密度。临床研究显示，在皮肤镜下银屑病患者皮损处组织可见大量血管结构，搔抓后可出现点状出血。本研究通过检测银屑病患者皮损处组织中VEGF、CD31和CD34的表达情况，探讨银屑病可能的发生机制，以期为临床诊治提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2018年3月—2020年5月在广州医科大学附属第五医院就诊的30例银屑病患者的临床资料及皮损处活组织，经临床、皮肤镜检查确认均处于疾病进行期，并纳入银屑病组；其中男18例、女12例，年龄范围为25～61岁，中位年龄为31岁。纳入标准：符合《中国临床皮肤病学》和《皮肤镜诊断图谱》银屑病进行期的诊断标准，即具有典型表现(临床表现为新皮疹不断出现，旧皮疹不断扩大，鳞屑厚积，炎症明显，周围有炎性红晕，瘙痒感较显著。皮肤镜表现为亮红色或鲜红色背景上弥漫性分布白色鳞屑，血管多为小球状、发夹状和环状)；3 个月内未系统使用糖皮质激素、维甲酸、免疫抑制剂等药物；1个月内未使用银屑病相关的口服、外用药物或光疗等。排除标准：妊娠期或哺乳期妇女；精神疾病患者；有其他系统性疾病或皮肤病患者。另取曾在急诊科行清创术的10例患者的皮肤组织样本作为对照组。取对照组和银屑病组各7例行分子生物学实验，本研究符合2013年修订的《赫尔辛基宣言》的要求，患者均签署知情同意书。

1.2 实验试剂 使用的试剂、试剂盒和抗体分别为RNA裂解液TRIzol[赛默飞世尔科技(中国)有限公司,批号为10296010]、反转录试剂盒(加拿大富酶泰斯生物公司, 批号为K1622)、SYBR Green RNA提取试剂盒[赛默飞世尔科技(中国)有限公司,批号为00720733]、RIPA裂解液[赛默飞世尔科技(中国)有限公司,批号为89900]、BCA蛋白检测试剂盒[赛默飞世尔科技(中国)有限公司,批号为UF281363]、DAB显色试剂盒[伯乐生命医学产品(上海)有限公司，批号为170-5060]、兔抗人CD31单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司，批号为77699S)、兔抗人CD34单克隆抗体(美国Abcam公司，批号为ab81289)、鼠抗人VEGF单克隆抗体(美国Santa Cruz公司，批号为sc-7269)、羊抗兔二抗[赛默飞世尔科技(中国)有限公司,批号为230194]、羊抗鼠二抗[赛默飞世尔科技(中国)有限公司,批号为31430]、超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司)。

1.3 检测方法

1.3.1 免疫组织化学染色 将经石蜡包埋好的组织块切成厚度为4 μm切片后，行60 ℃烤片1 h，予常规脱蜡、乙醇水化、抗原修复、一抗和二抗封闭后，进行染色。应用1×PBS代替一抗作为阴性对照组处理试剂，商品化的阳性片作为阳性对照组。

1.3.2 实时荧光定量PCR 采用TRIzol提取组织总RNA，按照试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA，操作步骤: 取RNA 4 μg，加入Oligo(dT)18 1 μL，加三蒸水将总体积补足至12 μL，65 ℃ 5 min，冰上静置3～5 min；再依次加入Ribolock RNase抑制剂1 μL，RevertAid M-MuLV逆转录酶1 μL， 5×反应缓冲液4 μL，10 mmol/L dNTP混合液2 μL, 置于PCR仪上进行反应。按程序25 ℃ 5 min、42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min运行。通过实时荧光定量PCR检测试剂盒检测相关基因的表达。扩增条件如下: 50 ℃ 2 min、 95 ℃ 2 min、95 ℃ 15 s、 60 ℃ 30 s，40个循环。以2-ΔΔct值计算各基因的相对表达量，结果以银屑病组相对于对照组的倍数表示。引物序列如下：VEGF正向引物为5’- GTG CCC ACT GAG GAG TCC A-3’, 反向引物为5’- GTG CTG GCC TTG GTG AGG T-3’; CD31正向引物为5’- AAC AGT GTT GAC ATG AAG AGC C-3’, 反向引物为5’- TGT AAA ACA GCA CGT CAT CCT T-3’; CD34正向引物为5’-CTA CAA CAC CTA GTA CCC TTG GA-3’,反向引物为5’-GGT GAA CAC TGT GCT GAT TAC A-3’; GAPDH正向引物为5’-AAT GGG CAG CCG TTA GGA AA-3’,反向引物为5’-GCC CAA TAC GAC CAA ATC AGA G-3’。

1.3.3 免疫印迹试验 将收集的银屑病皮损处及正常皮肤组织充分剪碎，用RIPA裂解液裂解，匀浆机匀浆，收集蛋白裂解液，经12 000×g，离心15 min后，采用BCA法测定蛋白质浓度。每孔蛋白质上样量为20 μg，加入10%十二烷基硫酸钠(SDS)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，后用湿转法将蛋白质转移至0.22 μm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。在常温下，用含5%脱脂牛奶的TBST溶液封闭含目的蛋白质的PVDF膜条带2 h后， 在4 ℃下，将条带与抗 VEGF(1∶500)、CD31(1∶1 000)和CD34(1∶1 000)单克隆抗体、抗β-actin(1∶3 500)单克隆抗体共同孵育过夜，经TBST洗涤3次后与相应的二抗(1∶5 000)在室温下共孵育2 h，经TBST洗涤3次后，加入ECL试剂显影，定影晾干后拍照，分析目的条带的灰度值。

1.4 结果判断标准 VEGF免疫组织化学染色以切片组织的细胞核或细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性反应，阴性对照组除细胞核染成蓝色外，细胞膜和细胞质中应无棕黄色反应物。CD31、CD34定位于血管内皮细胞的细胞质。在染色成功的区域挑选5个高倍镜视野，根据阳性染色细胞面积的百分率进行相应评分：<25%为1分，25%～50%为2分，>50%为3分。同时对着色强度进行评分：无色为0分，浅棕色为1分，棕黄色为2分，棕红色为3分。

2 结 果

2.1 皮损处皮肤镜下组织表现和临床大体表现 皮肤镜下疾病的典型表现为亮红色背景，其上有白色鳞屑，可见弥漫性分布的点状、小球状、肾小球样和环状血管(图1A、1B)。患者皮损处的大体照片可见鲜红斑块附有大量银白色鳞屑，边界清晰，部分皮损处可见血痂附着(图1C、1D)。

A 皮肤镜下见淡红色背景上红色点状、短棒状血管规则分布，有银白色鳞屑附着(×50) B 红色背景、曲折扩张的肾小球样毛细血管呈均匀、规则的散在分布(×200) C、D 大体观见鲜红斑块上大量银白色鳞屑，边界清晰，可见血痂附着

2.2 皮损处组织病理学染色与免疫组织化学染色结果 H-E染色显示银屑病组患者皮损处组织角化过度伴角化不全，Munro微脓疡和(或)Kogoj海绵状脓疡形成，颗粒层变薄或消失，表皮银屑病样增生，真皮层乳头水肿伴血管扩张，周围淋巴细胞浸润(图2A、2B)。CD31、CD34 阳性染色位于银屑病组患者皮损处组织血管内皮细胞的细胞质中，呈条状或环状弥漫分布；对照组组织的血管内皮细胞的细胞质中少量表达CD31、CD34(图2C～2F)。VEGF在银屑病组患者的皮损处组织中表达遍布表皮全层，以棘层染色最强，基底层细胞染色明显减弱或不染色，且主要表达于角质形成细胞的细胞质，为细胞内的颗粒状棕黄色染，真皮浅层浸润的部分炎症细胞的细胞质内亦可见阳性表达(图2G、2H)。与对照组相比，银屑病组患者皮损处组织的VEGF、CD31和CD34免疫组织化学染色评分显著增加(P值均<0.05)。见表1。

表1 两组免疫组织化学染色评分的比较 分)

A、B 对照组、银屑病组(H-E染色，×40) C、D 对照组、银屑病组(CD31免疫组织化学染色，×40) E、F 对照组、银屑病组(CD34免疫组织化学染色，×40) G、H 对照组、银屑病组(VEGF免疫组织化学染色，×40)

2.3 皮损处皮肤组织血管标志物的表达 银屑病组患者皮损处组织中的VEGF、CD31和CD34的mRNA表达量显著高于对照组(P值均<0.05)，见表2。 银屑病组患者皮损处组织中的VEGF、CD31和CD34的蛋白质水平显著高于对照组(P值均<0.05)，见图3。

图3 两组患者皮损处皮肤组织血管标志物蛋白质的表达情况

表2 两组皮肤组织血管标志物的mRNA表达量的比较

3 讨 论

银屑病是一种常见的慢性、复发性、炎症性皮肤病。典型损害表现为红色斑块上覆盖银白色鳞屑，皮肤常常伴有瘙痒、皲裂和疼痛等，甚至伴有全身症状。此外，外在皮损引发的变化给患者带来极大的心理负担[7]。目前，银屑病的发病机制尚未完全清楚，本研究发现进行期银屑病患者皮损处组织中VEGF水平升高，同时血管内皮细胞标志物表达上调，提示血管增生在银屑病的发生、发展中具有重要作用。

银屑病的组织病理学表现为表皮角化过度、角化不全、棘层肥厚，真皮乳头血管扩张和以淋巴细胞为主的炎细胞浸润[8]。通过皮肤镜检查发现银屑病患者皮损处可见大量血管结构，典型皮肤镜检查表现为均匀且规则分布的血管模式、红色点状血管、淡红色背景，并且以上3种表现同时存在的特异性为99%。

VEGF 是一种作用强，且特异性作用于内皮细胞的有丝分裂原，其不仅可以促进真皮血管内皮细胞分裂增生，还可以增加血管通透性，并对炎症细胞、内皮细胞有化学趋化作用。本研究发现，银屑病组患者皮损处组织中VEGF的mRNA和蛋白质表达量均显著升高，提示其可能是银屑病血管异常生成的重要促进因子，这为抗血管生成药物治疗银屑病提供了理论依据。

近年来，VEGF在银屑病发病中的作用研究有逐渐增多的趋势，其作为一种促血管生成因子，在血管生成过程中发挥重要作用。CD31是目前广泛使用的血管内皮细胞的标志物，其在血细胞如血小板、巨噬细胞和淋巴细胞等中也有表达[9]。CD34是泛血管内皮标志物之一，被认为是重复性好、稳定性高、较成熟的血管内皮标志物[10]。鉴于CD31、CD34是较理想的血管内皮细胞标志物，因此本研究以抗CD31、CD34为标记抗体，发现银屑病患者皮损处组织中CD31、CD34蛋白质表达量明显增高，与对照组相比，差异有统计学意义。同时，本研究发现，在进行期银屑病皮损处组织中有大量的血管内皮细胞生成，推测血管生成在银屑病的发生中可能发挥了作用。VEGF、CD31和CD34在肺癌、肝癌等肿瘤中的研究较多，但目前鲜见文献报道这三者在银屑病中共同表达的情况。本研究采用3种不同的方法证实在进行期银屑病组织中VEGF、CD31和CD34的mRNA、蛋白质水平存在高表达。在疾病进行期，大量内皮细胞增生、毛细血管生成促进了银屑病病情的进展，说明皮肤镜检查结果可作为诊断银屑病的据依，为临床诊治提供思路。

综上所述，血管生成源于血管生成因子的产生，其中活性最强的VEGF负责内皮细胞的活化、增殖并迁移到血管周围区域，从而形成大量的血管结构促进银屑病表皮增生。因此，笔者推测银屑病皮损各个时期的发展变化均可能以血管病变为基础，上述假设有待进一步的研究予以证实。