p38MAPK信号通路介导miR-21在缺血再灌注肾损伤中的作用机制

刘恋红， 李志辉

急性肾损伤是指各种原因所致的肾脏功能短期内急剧下降或丧失的一组临床综合征。目前全球每年约有15%患者，也就是约1 300万急性肾损伤患者，其中约170万人死亡[1-2]。缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)损伤是急性肾损伤最常见病因之一，约50%的急性肾损伤住院患者是由IR损伤所致[3]。大量文献报道，肾脏IR损伤中出现的肾小管上皮细胞凋亡、炎症因子的产生均与p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinases，p38MAPK)磷酸化密切相关[4]，抑制p38MAPK磷酸化可能是减轻肾脏IR损伤的重要靶点。据文献报道，IR损伤中，各种刺激因子可调控p38MAPK及上游蛋白激酶可介导细胞及组织器官损伤。Ashraf等[5]指出，在IR损伤模型中，p38MAPK激活后使得线粒体中活性氧表达水平上调，证实了p38MAPK为活性氧上游激酶，而在使用p38MAPK的抑制剂Doramapimod(BIRB796)后，活性氧水平降低及细胞凋亡率减少。Xi等[6]研究表明，在系膜细胞培养中，转化生长因子-β1 (transforming growth factor,TGF-β1)可诱导细胞的增殖与细胞基质的生长，增加环氧酶-2、前列腺素E2合酶-1和前列腺素E2的表达，并促进p38MAPK与细胞外调节蛋白激酶磷酸化，加剧TGF-β1介导的肾脏IR损害。Hong等[7]研究表明，二氧化钛纳米粒通过TGF-β/Smads/p38MAPK通路介导肾脏炎症反应及纤维化。以上均可说明p38MAPK在炎症反应、细胞凋亡、肾脏纤维化中的重要作用。

本课题组前期研究发现，microRNA-21(简称miR-21)参与了肾脏IR损伤的调控，丝裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated- protein kinase kinase3，MKK3)是miR-21-5p靶基因，miR-21在基因和蛋白质水平下调MKK3的表达[8]。而MKK3是p38MAPK的上游激活分子，能特异性磷酸化p38MAPK而调控p38MAPK信号通路。因而本研究建立了小鼠IR肾损伤及缺血预处理后IR肾损伤模型，旨在探讨miR-21、p38MAPK、p-p38MAPK、IR损伤之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 选取C57BL/6J雄性小鼠200只(许可证号：SCXK(湘)2011-0003)，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，6～8周龄，体质量20～22 g。按随机数字表法分为空白对照组、IR组、假手术组及缺血预处理再灌注组(IPC+IR组)。除空白对照组以外，其他3组依据再灌注后的时间点(0 min、5 min、30 min、45 min、2 h、12 h、24 h、48 h)分成8个亚组，每亚组小鼠8只。

1.2 动物模型 小鼠适应性饲养1周后构建模型：(1)空白对照组：直接取出肾脏，不做任何处理。(2)IR组：采用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠后经腹正中切口开腹，暴露肾蒂，予无损伤动脉夹夹闭双侧肾蒂30 min后松开，建立IR肾损伤模型。(3)假手术组：游离双侧肾蒂但不夹闭，4 d后按IR组方法建立IR肾损伤模型。(4)IPC+IR组：按以上相同方法开腹，首先行双侧肾蒂夹闭15 min再灌注，4 d后按IR组方法建立IR肾损伤模型。

1.3 方法 将新鲜摘除的肾脏提取肾组织RNA，应用mRNA实时定量PCR试剂盒对合成的cDNA进行实时定量PCR反应测得肾组织miR-21表达水平；采取免疫组织化学法及蛋白印迹法测得肾脏组织中p38MAPK、p-p38MAPK表达水平；盲法取皮髓质交接部观察肾脏病理得肾小管间质面积评分。正常记0分，肾小管间质受损的面积<10%记0.5分，10%～25%记1分，>25%～50%记2分，>50%～75%记3分，>75%记4分，采用此半定量分析法计算平均值，分值越高，损害越重。

2 结果

2.1 肾组织miR-21表达水平 空白对照组中miR-21表达水平在各亚组均呈较低水平表达。IR组miR-21表达水平在IR后5 min开始上升，于再灌注24～48 h达高峰，为基线值的15.2倍。IPC+IR组中，在预缺血处理后，miR-21表达增高，在之后IR各个时间点均保持在较高水平，约为基线值14.8倍(图1)。假手术组miR-21表达水平基本与IR组表达一致。

图1 各组小鼠肾组织miR-21的表达水平

2.2 各组小鼠肾组织p38MAPK及p-p38MAPK蛋白质的表达水平

2.2.1 蛋白印迹法检测各组小鼠肾组织p38MAPK及p-p38MAPK的动态变化 各组小鼠肾组织在各组各时间点的p38MAPK蛋白质的相对表达水平(p38MAPK/β-actin)比较差异均无统计学意义(P>0.05)。在IR组、假手术组、IPC+IR组IR后p-p38MAPK相对表达水平(p-p38MAPK/p38MAPK)比较差异有统计学意义(P<0.01)。假手术组与IR组各亚组间的p-p38MAPK相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。IPC+IR组与假手术组、IR组各亚组间p-p38MAPK相对表达水平差异有统计学意义(P<0.01)，见表1和图2。

表1 各组小鼠肾组织p-p38MAPK/p38MAPK相对表达水平比较

注：1～8代表再灌注后各时间点。1：0 min；2：5 min；3：30 min；4：45 min；5：2 h；6：12 h；7：24 h；8：48 h图2 各组小鼠肾组织p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达水平的变化

2.2.2 小鼠IR后肾脏病理及肾小管间质损伤评分 空白对照组肾小管间质无明显损害，IR组小鼠肾脏病理损害随再灌注时间的推移逐渐加重，24 h达到高峰，此时有大范围肾小管上皮细胞肿胀、变性，少量可见细胞碎片、红细胞管型。部分肾小管上皮细胞刷状源扁平、管腔扩张，部分肾小管上皮细胞片状坏死、脱落，肾小管基底膜裸露。假手术组肾脏病理损伤与IR组基本相同；IPC+IR各亚组肾脏病理损伤的变化趋势与IR组一致，但损伤程度较IR组明显减轻，见图3(封三)。肾小管间质损伤评分见表2。

表2 各组小鼠肾小管间质病理损伤评分比较分)

表2结果表明，IR组、假手术组、IPC+IR组各亚组肾小管间质评分比较差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

急性肾损伤是临床上十分常见的危急重症，在院期间发生急性肾损伤后明显增加死亡率、增加住院时间、增多住院费用及影响愈后[9]。儿童的急性肾损伤发生率更是逐年上升，据McGalliard等[10]一项大型、前瞻性的单中心危重儿童队列研究发现，严重的急性肾损伤的发生率为15.8%，死亡率6.1%。而IR损伤是急性肾损伤的重要原因，IR损伤包括缺血、肾毒素所致细胞直接损害以及系统性炎症反应所致延续性损伤[11]。本研究即构建小鼠IR肾损伤模型，旨在探讨IR损伤中炎症通路的作用机制。

近年来关于miRs在IR损伤中的作用机制得以广泛研究。miRs可以通过多种途径参与IR损伤炎症过程的调控，与中性粒细胞明胶相关脂质运载蛋白类似，存在于人体血、尿液中，故有望作为急性肾损伤早期诊断的生物学标记物[12-14]。有研究表明，miR-21在肾脏IR后显著上调，证实其与IR损伤存在密切关系[15]。本研究组前期已通过生物信息学方法预测并证实了miR-21与MKK3存在靶向调节关系[8]。理论上MKK3是p38MAPK的上游，可通过对p38MAPK双位点磷酸化而激活此信号通路。故p38MAPK信号通路与IR损伤之间同样存在密切联系。本研究结果显示，在IR模型中，随着IR时间推移，p38MAPK逐渐磷酸化，在2 h达到峰值；说明IR迅速启动p38MAPK信号通路；而通过预缺血处理，p38MAPK磷酸化仍在2 h达到峰值，相较于IR组，p-p38MAPK/p38MAPK相对表达水平比值明显降低，说明预缺血处理可保护肾脏，其保护机制即减少p-p38MAPK的表达水平，从而使得下游炎症因子激活减少，减轻炎症反应。

本研究中，IR组，miR-21随着再灌注时间增加，表达逐渐升高，峰值与肾脏病理损害最重时间点重合。说明miR-21与肾脏IR损伤确实是密切相关的。通过对IR损伤模型先进行缺血预处理，在IPC的4 d之后再进行IR，发现miR-21表达水平维持在14.8倍基线值，p38MAPK蛋白表达水平趋势与IR组并无明显差别，在2 h达到峰值。也再次说明其灵敏度高的特点。但很显然各个点的表达量有所下调，且在24 h表达水平降低相对幅度最大，24 h肾脏病理较IR组损害明显减轻。表明在IPC后，miR-21可一定程度上调节p38MAPK信号通路。但p38MAPK之所以与miR-21表达趋势不一致，主要考虑以下几种可能原因：(1)p38MAPK属于灵敏度很高的蛋白激酶，对于外来的各种刺激非常敏感，只要受外来刺激立刻可以被激活，所以峰值来得较早。(2)已知p38MAPK分有4个亚型：p38α、p38β、p38γ、p38δ，而分布在肾脏的主要为α、β、δ三型，而MKK3主要可对α、β、γ三型所激活。(3)并且p38MAPK上游激酶不仅只有MKK3，所以即便miR-21靶向调控MKK3，在24 h时间点MKK3的表达水平最低，而p38MAPK的磷酸化程度不一定最低。但从本课题两部分中的p-p38MAPK表达水平的变化，以及课题组前期实验成果，可以合理推断：上调的miR-21可以靶向低调MKK3，并可以一定程度上抑制p38MAPK的磷酸化，减轻炎症反应，从而减少小鼠模型的肾脏损害。

综上所述，在小鼠IR损伤模型中，通过IPC后，高表达miR-21可能靶向低调了MKK3的表达，进而介导了p38MAPK信号通路，减轻炎症反应，减轻小鼠肾脏的损害，起到一定保护作用。然而，因为miR-21分子具有多靶向性，生物学功能多样化，p38MAPK具有非常高的灵敏度，是否能通过有效手段抑制两者，作为减轻肾脏IR损伤的新干预的靶点应用于临床仍有待于以后更进一步的研究证实。